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ヘマグルチニンエステラーゼ（HEs）は、特定のエンベロープウイルスが持つ糖タンパク質であり、侵入メカニズムとして利用されます。HEsは、宿主細胞表面に存在する特定のシアル酸受容体の付着と破壊を助けます。[ 1 ] HEsを持つウイルスには、インフルエンザCウイルス、トロウイルス、およびエンベコウイルス亜属のコロナウイルス（ SARS様コロナウイルスは含まれません）などがあります。HEsは、 2つのモノマーからなる二量体膜貫通タンパク質であり、各モノマーは3つのドメインで構成されています。3つのドメインは、膜融合ドメイン、エステラーゼドメイン、および受容体結合ドメインです。
HEのさまざまな酵素活性には、受容体結合活性、受容体加水分解（エステラーゼ）活性、および膜融合活性が含まれます。受容体結合活性は、HEが糖脂質および糖タンパク質のN-アセチル-9-O-アセチルノイラミン酸（9-O-Ac-Neu5Ac）に結合し、ウイルス受容体として機能することを含みます。[ 2 ]受容体加水分解（エステラーゼ）活性は、末端の9-O-Ac-Neu5Ac残基のC9位からアセチル基を除去することにより、ウイルス粒子が感染細胞から脱出することを可能にします。 [ 2 ]膜融合活性は、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜間の結合を強化することにより、ウイルスゲノムを宿主細胞の細胞質に組み込むのに役立ちます。
特定のインフルエンザウイルスでは、細胞表面は酵素活性を持つヘマグルチニン（HA）とノイラミニダーゼ（NA）タンパク質の両方から構成されていますが、ヘマグルチニン-エステラーゼ融合（HEF）タンパク質は、上記のすべての酵素活性を組み合わせた主要な単一スパイクタンパク質であることがわかっています。HEFタンパク質は高温および低pH耐性であることが試験されており、ウイルスの病原性の主要な源となっています。[ 3 ]インフルエンザCは、インフルエンザAおよびBと比較して、宿主細胞への感染能力を高める独自のHEF構造タンパク質を持っていることが示されています。
ヘマグルチニンエステラーゼタンパク質の異なるドメインの折り畳みは、小胞体からゴルジ装置へのタンパク質の細胞内輸送に重要である。HE酵素のE、F、およびRドメインにおけるオリゴ糖鎖の存在も細胞内輸送に影響を与える。ヘマグルチニンエステラーゼのアシル化は、ウイルス粒子の組み立て複製において重要な役割を果たすことが示されている。酵素触媒切断の正確なプロセスはまだ詳細に解明されていない。しかし、ヘマグルチニンエステラーゼの膜融合活性の前にタンパク質分解切断が起こる必要がある。HEFタンパク質は、独特のスパイク六角形配列を持つ。この特徴はインフルエンザCウイルス粒子に特有のものである。この配列は粒子の外側を覆うものである。
いくつかの研究により、コロナウイルスとトロウイルスの HE は、インフルエンザ C ウイルスに見られる HEF 糖タンパク質に由来し、ヘマグルチニン エステラーゼが三量体から二量体糖タンパク質に変化した結果生じたことが明らかになった。[ 1 ]この過程で、受容体破壊酵素アセチル エステラーゼ ドメインは変化しなかった。しかし、HE 受容体結合ドメインは変化し、リガンドは以前とは逆の向きで結合するようになった。[ 1 ]コロナウイルスとトロウイルスの HE モノマーはどちらも、中央のエステラーゼ/加水分解酵素ドメイン、受容体結合レクチンドメイン、および膜近位ドメインという3 つのドメインで構成されている。[ 4 ] CoV と ToV の両方の HE 二量体の 2 つのモノマーは、同じ 2 つの接触領域 (CR 1 と 2) に関与している。CR 1 には受容体結合ドメインが含まれ、接触領域 2 には膜近位ドメインが含まれる。しかし、ToV HE 接触領域 2 には追加のエステラーゼ ドメインが含まれる。その結果、ToV HE の CR 2 表面積は CoV HE よりも大きい。しかし、カルボキシル末端膜アンカーの近くには、コロナウイルス HE のCys 385間に多数のジスルフィド結合があり、それが HE 二量体を互いに連結させている。[ 4 ]
CoV HEでは、2つのRドメインβシートが互いに連結して、二量体界面を横切る連続した分子間βシートを形成している。一方、ToVでは、それらは角度をつけて配置されている。その結果、ToVの受容体結合ドメインのβシートはCoVに比べてよりねじれており、接触領域1は小さく、Rドメインの位置はβストランドに沿ってずれている。[ 4 ]
「電子顕微鏡を用いた初期の研究では、HEFスパイクは膜に近い茎と球状の頭部からなるキノコ状の三量体を形成することが示された。」[ 2 ]
その後の研究では、ブロメラインで切断された細胞外ドメインのX線結晶構造解析 を用いて、ヘマグルチニンエステラーゼ融合三量体のより高解像度の構造（4.5 Å）を調べ、示すことができた。ヘマグルチニンとヘマグルチニンエステラーゼ融合タンパク質は、構造と個々のセグメントの折り畳みに関しては類似している。しかし、HAとHEFの間で同一なアミノ酸はわずか12%である。HEとHEFの重要な違いの1つは、HEF球状ドメイン（ドメインの下部）にエステラーゼ領域を含む追加の膨らみが存在することである。HAとHEFの両方の受容体結合領域はドメインの上部にあり、HEF1残基のみを含む。ストークは、HEF2配列のすべての配列と、N末端残基（1～40）およびC末端残基（367～432）である特定のHEF1残基を含む3つの60 Å長のαヘリックスで構成されている。[ 2 ]
結晶構造は、HEFが9-O-Ac-Neu5Acに結合する方法がHAがNeu5Acに結合する方法と同じであることを示している。結合部分はαヘリックス、ループ、および伸長したストランドから構成される。アミノ酸（Tyr127、Thr170、Gly172、Tyr227、およびArg292）とリガンドの水酸基との間には水素結合が存在し、他の残基が受容体結合部位の構造的サポートを形成している。HEF結合部位には、アセチルメチル基を収容する独特の疎水性ポケットが存在する。[ 2 ]
糖脂質と糖タンパク質には、HEFが結合するウイルス受容体として機能するN-アセチル-9-O-アセチルノイラミン酸（9-O-Ac-Neu5Ac）が含まれています。HEFは、9-O-Ac-Neu5Acが次のガラクトシル残基にα-2,3結合またはα-2,6結合で結合しているかどうかにかかわらず、その受容体に結合できます。ただし、宿主特異性は、末端のN-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）とNeu5Acのグリコシド結合によって影響を受ける可能性があります。インフルエンザCウイルスは、独自の受容体特異性により、さまざまな細胞の表面にある9-O-Ac-Neu5Acを認識できます。[ 2 ]
HEFの受容体加水分解酵素活性は、末端9-O-Ac-Neu5AcのC9位からアセチル基を切断するエステラーゼ酵素を用いて、感染細胞からのウイルス粒子の放出を助けます。セリン加水分解酵素クラスに属するHEFのエステラーゼ活性は、他の2つのアミノ酸（ヒスチジンとアスパラギン酸）の助けを借りて、セリンアミノ酸の水酸基（OH）が基質のカルボニル基に求核攻撃することを含みます。塩基性ヒスチジンは、水酸基を分極および脱プロトン化することにより、セリンの反応性を高めます。それに加えて、アスパラギン酸はヒスチジンを分極します。[ 2 ]
HEFの結晶構造のX線結晶解析により、セリン57、アスパラギン酸352、ヒスチジン355がエステラーゼ活性に重要なアミノ酸であることが示された。また、初期の研究では、Ser57およびHis355残基の変異によりHEFのエステラーゼ活性が完全に停止することが示された。[ 2 ]
ウイルスエンベロープと宿主細胞のエンドサイトーシス小胞との間の膜融合活性は、ウイルスがゲノムを細胞の細胞質に注入するのを助けるために重要である。膜融合を活性化するためには、前駆体タンパク質HEF0とHA0をサブユニットHEF1とHEF2に切断し、これらのタンパク質を酸性pHに曝露することが事前に必要である。[ 2 ]
酸性pHは特定のアミノ酸のプロトン化を引き起こし、タンパク質の特定の再配置を開始させます。プロトン化されたアミノ酸はヒスチジンであり、そのpKaはエンドソームのpHと一致します。研究によると、インフルエンザAとCの両方の株間で膜融合活性を引き起こすpH値に約0.7の差があることが示されています。[ 2 ]
低pHで起こるHEF構造のコンフォメーション変化により、融合ペプチドがストークの下部から分離し、分子の外面が露出するため、エンドソーム膜に挿入される。別のコンフォメーション変化により、エクトドメインが曲がり、融合ペプチドが膜貫通領域に向かって押し出される。その結果、ウイルス膜とエンドソーム膜が接近し、ヘミフュージョンによって脂質が交換される。その後、融合孔が開き、最終的に両方の脂質二重層が完全に融合する。[ 2 ]
ヘマグルチニンエステラーゼタンパク質の折り畳みと、タンパク質のドメインの組み立て方は、膜タンパク質と分泌タンパク質を小胞体からゴルジ体へ輸送するのに寄与している。研究者らは、三量体化は小胞体から出る前の段階で起こることを発見した。[ 5 ] HEタンパク質のモノマーは、組み立てが可能になる前に折り畳まれる。ヘマグルチニンエステラーゼがゴルジ体へ報告する前に、広範囲に折り畳まれ、組み立てられる必要がある。
ヘマグルチニンエステラーゼの構造は細胞内輸送に寄与する。インフルエンザCウイルスのヘマグルチニンエステラーゼ（HE）糖タンパク質は、膜融合に活性なステムドメイン（F）、アセチルエステラーゼドメイン（E）、および受容体結合ドメイン（R）の3つのドメインから構成される。[ 6 ]このタンパク質には8つのN結合型糖鎖付加部位があり、Fドメインに4つ（位置26、395、552、および603）、Eドメインに3つ（位置61、131、および144）、Rドメインに1つ（位置189）存在する。[ 6 ]ドメイン内のオリゴ糖鎖は細胞内輸送に影響を与える。研究では、E ドメイン (位置 144) に加えて F ドメイン (位置 26 および 603) の 2 つの部位でのグリコシル化が HE 分子の小胞体からの輸送に必要であり、これら 3 つの部位のいずれかを欠く変異 HE は三量体形成に失敗したことが明らかになった。[ 6 ]オリゴ糖は F ドメインと R ドメインのエステラーゼ活性を維持するために必要である。いずれかのドメインにオリゴ糖鎖が欠けている場合、細胞表面発現に影響が出る。HE モノマーはオリゴ糖鎖が欠けていても完全な酵素活性を持っていたため、アセチルエステラーゼ活性を持っていることがわかった。[ 6 ]オリゴ糖鎖は細胞内輸送には重要であるが、融合活性には重要ではない。したがって、オリゴ糖鎖は実際には膜融合を促進しない。
インフルエンザCウイルスのウイルス複製には、ヘマグルチニンエステラーゼ酵素のアシル化が必要である。HEFのアシル化部位を欠損した組換えウイルスは救済できることがわかったが、ウイルス力価は野生型Flu Cに比べて1桁減少した。 [ 2 ]得られたウイルス粒子は規則的なタンパク質組成を持ち、電子顕微鏡による形態の変化は明らかではなかったが、溶血活性が低下しており、膜融合の欠陥を示している。[ 2 ]これは、同様の結果を示したいくつかのHAタンパク質サブタイプと比較したものである。
ヘマグルチニンエステラーゼ融合タンパク質は、N-グリコシル化、ジスルフィド結合形成、S-アシル化、 HEF1およびHEF2サブユニットへのタンパク質分解切断などの共翻訳および翻訳後修飾を受ける。 [ 2 ]インフルエンザCウイルスのHEFタンパク質は、膜貫通システインに1つのステアリン酸が結合している。インフルエンザAおよびBウイルスのHAは、細胞膜のコレステロールおよびスフィンゴ脂質に富むナノドメインである膜ラフトに関連しているが、HEFは細胞膜のバルク相に局在すると考えられている。[ 2 ]
インフルエンザCウイルス粒子のヘマグルチニンエステラーゼ（CHE）タンパク質のシアル酸上の9- O-アセチル基に対する結合および切断特性は、ウイルス粒子全体を用いた様々なアッセイで利用されてきた。[ 7 ]
タンパク質分解による切断は、HEの膜融合活性の前に必ず起こらなければならない。なぜなら、これによりタンパク質が低pHで活性化されるからである。すべてのインフルエンザCウイルス株のHEFタンパク質は、モノ塩基性切断部位を含んでおり、この点ではヒト、ブタ、ウマ、および低病原性鳥インフルエンザAウイルスのHAと類似している。[ 2 ]高病原性鳥インフルエンザAウイルスのHAに存在し、遍在するプロテアーゼであるフリンによって処理されるポリ塩基性切断部位は、どのHEFタンパク質にも見られない。したがって、インフルエンザCウイルスの複製は、ウイルス感染部位である呼吸器系に限定される。[ 2 ]他のインフルエンザウイルスとは異なり、インフルエンザCウイルスは他の組織には広がらない。組織培養におけるインフルエンザCウイルスの複数回の複製サイクルは、トリプシンの添加によって可能になるが、胚発生卵は切断されたHEFを持つ感染性ウイルスを産生する。[ 2 ]
HEFのタンパク質分解を触媒する酵素はこれまで特定されていませんが、HAとHEFはどちらも試験管内で同様の濃度（5～ 20μg/mL）でトリプシンによって切断されるため、細胞内でも同じ酵素によって活性化される可能性が高いと考えられます。[ 2 ] HAとHEFは多くの文脈で比較されることが非常に一般的です。
インフルエンザCウイルスの唯一のスパイクであるヘマグルチニンエステラーゼ融合糖タンパク質（HEF）は、受容体結合、受容体加水分解、膜融合活性を兼ね備えている。[ 8 ]インフルエンザウイルスの他のヘマグルチニン糖タンパク質と同様に、HEFはSアシル化されているが、膜貫通領域の細胞質側末端に位置する単一のシステインにステアリン酸が結合しているだけである。 [ 8 ]しかし、このHEタンパク質は、構造組織にもスパイクがある。
球状粒子と線状粒子の両方の表面にある HEF 三量体は、主に六角形から構成されると説明されている網目構造に配置されている。[ 2 ]この特徴はインフルエンザ C ウイルス粒子に特有のものである。HEF を膜から取り除いても、元々持っていたポリマー網目構造は依然として見ることができる。これらの結果は、六角形配置が HEF の固有の特徴であり、M1 などの他のウイルス タンパク質を必要とせず、その形成には HEF の細胞外ドメイン間の側方相互作用が関与している可能性が高いことを示している。[ 2 ]ウイルス粒子内のスパイク配置の形成は、ウイルス粒子を覆ってコートのように機能する。これは、非極性分子が内部に存在する脂質二重層膜の疎水性効果に似ている。
HEFのN-グリコシル化部位は図1に示されている。1つのシークオンはHEF2に、6つはHEF1にある。球状ヘッドに3つ、ストークとヘッドをつなぐヒンジ領域に2つある。589番目の部位は膜貫通領域に近すぎてオリゴ糖転移酵素がアクセスできないため、グリコシル化されない。グリコシル化は宿主細胞によるタンパク質分解から保護し、抗原エピトープの提示に重要であるため、適切な折り畳みに不可欠である。[ 2 ]
インフルエンザ C の HEF の一次構造は 641 個のアミノ酸から構成されています。これは、短い N 末端切断可能なシグナル ペプチド、長い細胞外ドメイン、膜貫通領域、および非常に短い細胞質尾部を持つ典型的な1 型膜貫通タンパク質です。HEF は、N 末端からなる HEF1 と、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部からなる HEF2 の 2 つのサブユニットから構成されています。HEF の結晶構造を解析した電子顕微鏡では、HEF のスパイクが、膜に近い柄と球状の頭部からなるキノコ型の三量体を形成することが示されました。HEF はアスパラギン結合糖鎖のみを含み、 O 糖鎖付加は起こらないことを示しています。結晶構造における個々の糖鎖付加部位の位置は、高度に保存された 8 つのN 糖鎖付加配列のうち 7 つに位置しています。 1つはサブユニットHEF2にあり、残りの6つはサブユニットHEF1にあります。3つの部位は球状ヘッドにあり、2つはストークとヘッドをつなぐヒンジ領域にあります。結晶構造上の位置589にはグリコシル化されていない部位があり、これは膜貫通領域に近接しているためオリゴ糖転移酵素がアクセスできないためと考えられます。インフルエンザAのHAの位置は、炭水化物位置の大部分がより大きなサブユニットにある点でインフルエンザCと非常によく似ています。[ 2 ]
HEF1では、15個のシステイン残基のうち12個が6つの鎖内ジスルフィド結合を形成し、球状ヘッドドメインを安定化させている。成熟タンパク質では、ジスルフィド結合を形成しないシステイン残基が2つあり、Cys373とCys399である。これらは球状ヘッドとストーク領域をつなぐヒンジ部分に位置している。残りのシステイン残基は、三量体の底部付近にあるエクトドメイン領域でHEFと鎖間ジスルフィド結合を形成している。HEF2のこれらのジスルフィド結合により、サブユニットは膜融合を触媒する大きな構造変化を起こすことができる。[ 2 ]
インフルエンザCでは、サブユニットHEF1に15個のシステイン残基があり、そのうち12個は球状ヘッドドメインを安定化させる6つの鎖内ジスルフィド結合を形成します。2つのシステイン残基はHEFの適切な折り畳みと機能に必要ではなく、または接続ヒンジに位置する成熟タンパク質でジスルフィド結合を形成しません。残りのシステイン残基は、サブユニットHEF2のエクトドメインにある唯一のシステイン残基と鎖間ジスルフィド結合を形成します。この残基は三量体の底部に位置しています。比較すると、インフルエンザAでは、HA1とHA2をつなぐ1つの結合があり、ジスルフィド結合の分布は類似しており、大部分は鎖内結合です。HEF2およびHA2サブユニットにおけるジスルフィド結合のまれな存在により、これらのサブユニットは膜融合を触媒する大きな構造変化を実行できます。[ 2 ]
HEFがER内腔へ移行する過程で、N末端シグナルペプチドが切断され、糖鎖が付加される。ジスルフィド結合が形成され、再構築される。これらの修飾は分子の折り畳みと三量体化に影響を与える。これらのプロセスは、ERから貨物を排出するための前提条件である。その後、膜貫通領域の末端に位置するシステインに脂肪酸鎖が付加され、HEFは2つのサブユニットに切断される。このプロセスはウイルス複製に不可欠である。[ 2 ]
比較すると、インフルエンザA、B、Cは、スパイクタンパク質、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼがそれぞれ異なる。インフルエンザCのHEF表面糖タンパク質は、受容体結合、受容体不活性化、融合の3つの活性を持つ。受容体結合は、ウイルスが細胞表面のN-アセチル-9-O-アセチルノイラミン酸に結合するのを媒介し、受容体不活性化は、N-アセチル-9-O-アセチルノイラミン酸から9-O-アセチル基を遊離させ、融合活性は、HEFの2つのサブユニットへの翻訳後タンパク質分解切断と酸性環境への曝露に依存する。低pH条件下では、HEFの立体構造変化が起こる。インフルエンザAでは、サブユニットHEF2のN末端の疎水性配列の再配置が露出し、ウイルスエンベロープと標的細胞の膜との融合を誘導する。[ 9 ]ウイルスエンベロープを宿主細胞に融合させるもう 1 つの方法は、エンドサイトーシス小胞によるものです。HEF は炭水化物から末端シリカ酸残基を切断しませんが、N-アセチル-9-O-アセチルノイラミン酸の C9 位からアセチル基を除去します。これは、感染細胞から新たに芽生えたウイルス粒子を放出するために必要です。そうでなければ、受容体がまだ存在する場合、ウイルス粒子は形質膜に閉じ込められてしまいます[ 2 ]
インフルエンザCは、構造的構成要素によってインフルエンザAおよびBと区別されます。HEFの細胞質部分はアルギニン-トレオニン-リジンの3つのアミノ酸から構成されていますが、インフルエンザAおよびBでは10個のヘマグルチニンアミノ酸から構成されています。HEFの翻訳後修飾は、脂肪酸によるアシル化です。HEFに結合している脂肪酸としてステアリン酸が検出されましたが、他のすべての膜タンパク質にはパルミチン酸が見られました。[ 9 ]株の頻繁な再集合により、単一サブタイプで安定しています。これにより、ウイルスが宿主によりよく適応するのに役立つ新しい株が生まれます。[ 2 ]