脂質二重膜の融合

膜生物学において、融合とは、最初は別々であった 2 つの脂質二重層が疎水性コアを融合し、相互接続された 1 つの構造を形成するプロセスです。この融合が両方の二重層の両方のリーフレットまで完全に進行すると、水性ブリッジが形成され、2 つの構造の内部内容物が混ざり合うことができます。一方、各二重層の 1 つのリーフレットのみが融合プロセスに関与している場合、二重層は半融合していると言われます。半融合では、2 つの二重層の外側のリーフレットの脂質成分は混ざりますが、内側のリーフレットは別々のままです。各二重層に囲まれた水性内容物も分離されたままです。

融合は多くの細胞プロセスに関与しており、特に真核生物では、真核細胞が脂質二重膜によって広範囲に分割されているため、その傾向が顕著です。エキソサイトーシス、精子による卵子の受精、老廃物のリソソームへの輸送は、何らかの形の融合に依存する多くの真核生物プロセスのうちのほんの一部です。融合は、脂質を合成部位から必要な膜に輸送するための重要なメカニズムでもあります。病原体の侵入さえも融合によって制御される可能性があり、二重膜で覆われた多くのウイルスは、宿主細胞に侵入するための専用の融合タンパク質を持っています。

融合プロセスには 4 つの基本的なステップがありますが、これらの各ステップは実際には複雑な一連のイベントを表しています。^[1]まず、関与する膜が凝集し、互いに数ナノメートル以内に近づく必要があります。次に、2 つの二重層が非常に密接に接触する必要があります (数オングストローム以内)。この密接な接触を実現するには、2 つの表面が少なくとも部分的に脱水されている必要があります。これは、通常存在する結合表面水がこの距離で二重層を強く反発させるためです。3 番目に、2 つの二重層間の 1 つのポイントで不安定化が発生し、2 つの二重層の非常に局所的な再配置が誘発される必要があります。最後に、この点欠陥が大きくなると、2 つの二重層の成分が混ざり合い、接触部位から拡散します。半融合または完全融合のどちらが発生するかに応じて、膜の内部の内容もこの時点で混ざる場合があります。^[2]

この複雑な一連の出来事の背後にある正確なメカニズムは、まだ議論の余地があります。システムを単純化し、より決定的な研究を可能にするために、合成脂質小胞を用いた多くの実験が試験管内で行われてきました。これらの研究は、二価カチオンが、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピンなどの負に帯電した脂質に結合することによって、融合プロセスで重要な役割を果たすことを示しています。^[3]融合プロセスにおけるこれらのイオンの役割の1つは、二重層の表面の負電荷を遮蔽し、静電反発力を弱めて膜が互いに近づくようにすることです。しかし、Mg ²⁺とCa ²⁺の融合を誘発する能力には違いがあることが広く文書化されているため、これが唯一の役割ではないことは明らかです。Mg ^2+は広範な凝集を誘発しますが、融合は誘発しませんが、Ca ^2+は両方を誘発します。^[4]この相違は脱水程度の差によるものであると提案されています。この理論によれば、カルシウムイオンは荷電脂質とより強く結合するが、水とはそれほど強く結合しない。その結果、カルシウムが水に置き換わることで脂質-水界面が不安定になり、二重層間の密接な接触が促進される。^[5]最近提唱された別の仮説は、カルシウムの結合が不安定な横方向の張力を誘発するというものである。^{[6]カルシウム誘導融合のメカニズムが何であれ、}両性イオン脂質はこの影響を受けないため、初期の相互作用は明らかに静電気である。 ^{[7] [8]}

融合プロセスでは、脂質ヘッドグループは電荷密度に関与するだけでなく、脱水や欠陥核形成にも影響を与える可能性があります。これらの効果は、イオンの効果とは無関係です。非荷電ヘッドグループであるホスファチジルエタノールアミン（PE）が存在すると、ホスファチジルコリン二重層に組み込まれたときに融合が増加します。この現象は、カルシウムの影響に似た脱水効果として説明されている人もいます。^[9] PEヘッドグループはPCよりも水に結合しにくいため、より簡単に密着できる可能性があります。別の説明では、PEの化学的性質ではなく物理的性質が融合を誘発するのに役立つ可能性があります。融合の茎仮説によると、融合が発生するには、2つの二重層の間に大きく湾曲した橋が形成されなければなりません。^[10] PEはヘッドグループが小さく、逆ミセル相を容易に形成するため、茎モデルによると、これらの茎の形成を促進するはずです。^[11]この理論を支持するさらなる証拠として、特定の脂質混合物は、これらの反転相の転移温度以上に上昇した場合にのみ融合をサポートすることが示されているという事実があります。^{[12] [13]}このトピックも依然として議論の余地があり、融合プロセスで湾曲した構造が存在する場合でも、それが立方体、六角形、またはよりエキゾチックな拡張相であるかどうかについては文献で議論されています。^[14]

生体内での融合を考えると状況はさらに複雑になる。なぜなら、生物学的融合はほとんどの場合、膜関連タンパク質の作用によって制御されるからである。最初に研究されたこれらのタンパク質は、エンベロープウイルスが遺伝物質を宿主細胞に挿入できるようにするウイルス融合タンパク質であった（エンベロープウイルスとは脂質二重層に囲まれたウイルスで、タンパク質の外殻のみを持つウイルスもある）。ウイルス融合タンパク質には、大まかに言って、酸性とpH非依存性の2つのクラスがある。^[1] pH非依存性融合タンパク質は中性条件下で機能し、細胞膜と融合してウイルスが細胞内に侵入できるようにする。この仕組みを利用するウイルスには、HIV、麻疹、ヘルペスなどがある。インフルエンザに見られるような酸性融合タンパク質は、酸性エンドソームの低pHでのみ活性化され、細胞内に侵入するには まずエンドサイトーシスされる必要がある。

真核細胞は、全く異なるクラスの融合タンパク質を使用するが、その中で最もよく研​​究されているのはSNAREである。SNAREタンパク質は、すべての小胞細胞内輸送を指示するために使用される。長年の研究にもかかわらず、このタンパク質クラスの機能については、まだ多くのことがわかっていない。実際、SNAREが初期のドッキングに関連しているのか、それとも半融合を促進することによって融合プロセスの後半に関与しているのかについては、まだ活発な議論がある。^[16] SNAREまたは他の特定のタンパク質の役割が明らかになったとしても、これらのクラスには構造と機能の多様性があり、保存されているテーマはほとんどないため、融合タンパク質の統一的な理解は得られそうにない。^[17]

分子生物学および細胞生物学の研究では、人工的に融合を誘発することが望ましい場合が多い。これは前述のようにカルシウムの添加で達成できるが、カルシウムは他の多くの生化学的プロセスを調節しており、その添加は強い交絡因子となるため、この手順は実行不可能な場合が多い。また、前述のように、カルシウムは融合だけでなく大規模な凝集も誘発する。ポリエチレングリコール（PEG）を添加すると、顕著な凝集や生化学的破壊を伴わずに融合が引き起こされる。この手順は現在、 B細胞と骨髄腫細胞の融合など、広く使用されている。^[18]この組み合わせから得られる「ハイブリドーマ」は、関与するB細胞によって決定される目的の抗体を発現するが、骨髄腫成分のために不死化される。PEG融合のメカニズムは明確に特定されていないが、一部の研究者は、PEGが多数の水分子に結合することで、水の化学活性を効果的に低下させ、脂質ヘッドグループを脱水すると考えている。 ^{[19]融合は電気}穿孔法によって人工的に誘発されることもあり、電気融合と呼ばれるプロセスで行われる。この現象は電気穿孔法中に形成されるエネルギー的に活性なエッジによって生じ、これが2つの二重層間の茎の成長を核化する局所的欠陥点として機能すると考えられている。^[20]

あるいは、SNARE にヒントを得たモデル システムを使用して、脂質小胞の膜融合を誘導することもできます。これらのシステムでは、膜に固定された相補的な DNA、^{[21] [22] [23]} PNA、^[24]ペプチド、^[25]またはその他の分子^[26]が「ジッパー」のように結合し、膜を近づけます。このようなシステムは、将来、たとえば薬物送達などの実用的な用途に利用される可能性があります。^[27]おそらく最もよく研​​究されているシステム^[28]は、相補的な電荷を持つコイルドコイル形成ペプチドで構成されています (1 つは通常、正に帯電したリシンを過剰に運ぶためペプチド K と呼ばれ、もう 1 つは負に帯電したグルタミン酸でペプチド E と呼ばれます)。^[29]興味深いことに、膜融合が起こるには 2 つのペプチド間のコイルドコイル形成が必要であるだけでなく、ペプチド K が膜表面と相互作用して局所的な欠陥を引き起こすことも発見されました。^[30]

融合には、膜脂質の混合と内容物の混合という 2 つのレベルがあります。膜融合のアッセイでは、膜脂質の混合または融合体の水性内容物の混合が報告されます。

脂質混合を評価するアッセイでは、非放射エネルギー移動、蛍光消光、ピレンエキシマー形成などの濃度依存効果を利用します。

1. NBD-ローダミンエネルギー移動：^[31]この方法では、NBD（ドナー）とローダミン（アクセプター）の両方で標識された膜が、標識されていない膜と結合します。NBDとローダミンが一定の距離内にある場合、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）が発生します。融合後、プローブ間の平均距離が増加すると共鳴エネルギー移動（FRET）は減少し、NBDの蛍光が増加します。
2. ピレンエキシマー形成:ピレンモノマーとエキシマーの発光波長は異なります。モノマーの発光波長は約 400 nm、エキシマーの発光波長は約 470 nm です。この方法では、ピレンで標識された膜が標識されていない膜と結合します。ピレンは膜内で自己会合し、励起されたピレンが他のピレンを励起します。融合前は、発光の大部分はエキシマー発光です。融合後は、プローブ間の距離が長くなり、エキシマー発光の割合が減少します。^{[引用が必要]}
3. オクタデシルローダミンB自己消光: ^[32]このアッセイは、オクタデシルローダミンBの自己消光に基づいています。オクタデシルローダミンBの自己消光は、プローブが1～10モルパーセントの濃度で膜脂質に組み込まれたときに発生します[ ^33]。これは、ローダミン二量体が蛍光を消光するためです。この方法では、膜標識ローダミンが非標識膜と結合します。非標識膜との融合によりプローブが希釈され、蛍光が増加します。^{[34] [35]}このアッセイの主な問題は、自発的な移行です。

溶解、融合、または生理的透過性の結果としての小胞からの水性内容物の混合は、低分子量可溶性トレーサーを使用して蛍光測定法で検出できます。

1. ANTS/DPXを用いた蛍光消光アッセイ：^{[36] [37]} ANTSはポリアニオン性蛍光体であり、DPXはカチオン性消光剤である。このアッセイはそれらの衝突消光に基づいている。別々の小胞集団にそれぞれANTSまたはDPXをロードする。内容物の混合が発生すると、ANTSとDPXが衝突し、360 nmで励起して530 nmでモニタリングされたANTSの蛍光が消光される。この方法は酸性pHおよび高濃度で実行される。
2. ^{Tb 3+} /DPAによる蛍光増強アッセイ: ^{[38] [39]この方法は、Tb 3+} /DPA のキレートが Tb ³⁺単独よりも 10,000 倍蛍光を発するという事実に基づいています。Tb ³⁺ /DPA アッセイでは、別々の小胞集団に TbCl _{3または DPA をロードします。Tb} ³⁺ /DPA キレートの形成は、小胞融合を示すために使用できます。この方法は、タンパク質を含まない膜に適しています。^{[引用が必要]}
3. 単一分子DNAアッセイ。^[40] 5塩基対のステムとポリチミジンループから構成されるDNAヘアピンは、ステムの末端にドナー（Cy3）とアクセプター（Cy5）で標識され、v-SNARE小胞に封入されています。t-SNARE小胞には、複数の標識されていないポリアデノシンDNA鎖を別々に封入しました。直径が約100nmの2つの小胞がドッキングし、それらの間に十分な大きさの融合孔が形成されると、2つのDNA分子がハイブリダイズし、ヘアピンのステム領域が開き、Cy3とCy5の間のフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）効率（E）が高値から低値に切り替わります。

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