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N結合型糖鎖付加とは、生化学で研究されているN-グリコシル化と呼ばれるプロセスにおいて、複数の糖分子からなる炭水化物であるオリゴ糖（グリカンとも呼ばれる）が窒素原子（タンパク質のアスパラギン（Asn）残基のアミド窒素）に結合することである。 [ 1 ]結果として生じるタンパク質はN結合型グリカン、または単にN-グリカンと呼ばれる。
このタイプの結合は、多くの真核生物タンパク質の構造[ 2 ]と機能[ 3 ]の両方にとって重要である。N結合型糖鎖付加プロセスは真核生物と古細菌で広く起こるが、細菌では非常にまれである。糖タンパク質に付加されるN結合型糖鎖の性質は、タンパク質とそれが発現する細胞によって決定される[ 4 ] 。また、種によっても異なる。異なる種は異なるタイプのN結合型糖鎖を合成する。
糖タンパク質には2種類の結合が存在する。1つはグリカン中の糖残基間の結合、もう1つはグリカン鎖とタンパク質分子間の結合である。
糖鎖では、糖部分がグリコシド結合によって互いに連結されています。これらの結合は通常、糖分子の炭素1と4の間で形成されます。グリコシド結合の形成はエネルギー的に不利であるため、この反応は2分子のATPの加水分解と共役しています。[ 4 ]
一方、タンパク質へのグリカン残基の結合には、コンセンサス配列の認識が必要である。N結合型グリカンは、ほとんどの場合、 Asn–X– Ser / Thrコンセンサス配列の一部として存在するアスパラギン（Asn）側鎖の窒素原子に結合する。ここで、Xはプロリン（Pro）以外の任意のアミノ酸である。 [ 4 ]
動物細胞では、アスパラギンに結合しているグリカンはほぼ例外なくβ配置のN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）である。 [ 4 ]このβ結合は、上述のグリカン構造における糖部分間のグリコシド結合に類似している。アノマー炭素原子は、糖のヒドロキシル基に結合しているのではなく、アミド窒素に結合している。この結合に必要なエネルギーは、ピロリン酸分子の加水分解から得られる。[ 4 ]
N結合型糖鎖の生合成は、主に3つの段階を経て起こる。[ 4 ]
前駆体オリゴ糖の合成、一括輸送、および初期トリミングは小胞体（ER）で行われる。オリゴ糖鎖のその後の処理と修飾はゴルジ体で行われる。
糖タンパク質の合成は、細胞内の異なる区画に空間的に分離して行われる。したがって、合成されるN-グリカンの種類は、これらの細胞区画に存在する様々な酵素へのアクセスしやすさに依存する。
しかし、多様性にもかかわらず、すべてのN-グリカンは共通のコアグリカン構造を持つ共通の経路で合成されます。 [ 4 ]コアグリカン構造は基本的に2つのN-アセチルグルコサミンと3つのマンノース残基 から構成されています。このコアグリカンはその後さらに展開および修飾され、多様なN-グリカン構造が生まれます。[ 4 ]
N結合型糖鎖付加の過程は、ドリコール結合型GlcNAc糖の形成から始まる。ドリコールは、イソプレン単位が繰り返し結合した脂質分子である。この分子はER膜に付着している。糖分子はピロリン酸結合を介してドリコールに結合する[ 4 ]（1つのリン酸は元々ドリコールに結合しており、2つ目のリン酸はヌクレオチド糖由来である）。その後、オリゴ糖鎖は様々な糖分子を段階的に付加することによって伸長され、前駆体オリゴ糖が形成される。
この前駆体オリゴ糖の組み立ては、フェーズIとフェーズIIの2つの段階で起こります。[ 4 ]フェーズIはERの細胞質側で起こり、フェーズIIはERの内腔側で起こります。
タンパク質に転移される準備が整った前駆体分子は、2つのGlcNAc、9つのマンノース、および3つのグルコース分子から構成されている。
前駆体オリゴ糖が形成されると、完成したグリカンはER膜の内腔にある新生ポリペプチドに転移されます。この反応は、ドリコール-グリカン分子間のピロリン酸結合の切断によって放出されるエネルギーによって駆動されます。グリカンが新生ポリペプチドに転移される前に満たさなければならない条件が3つあります。[ 4 ]
オリゴ糖転移酵素は、共通配列を認識し、小胞体内で翻訳されているポリペプチド受容体へ前駆体糖鎖を転移させる酵素である。したがって、 N結合型糖鎖付加は翻訳と同時に起こる現象である。
N-グリカン処理は小胞体とゴルジ体で行われる。前駆体分子の最初のトリミングは小胞体で行われ、その後の処理はゴルジ体で行われる。
完成したグリカンを新生ポリペプチドに転移すると、構造から 2 つのグルコース残基が除去されます。グリコシダーゼと呼ばれる酵素が糖残基の一部を除去します。これらの酵素は水分子を使用してグリコシド結合を切断することができます。これらの酵素はグリカンの非還元末端にある単糖残基にのみ作用するため、エキソグリコシダーゼと呼ばれます。 [ 4 ]この最初のトリミングステップは、タンパク質の折り畳みを監視するために ER での品質管理ステップとして機能すると考えられています。
タンパク質が正しく折り畳まれると、グルコシダーゼI と II によって 2 つのグルコース残基が除去されます。最後の 3 番目のグルコース残基が除去されると、糖タンパク質が ER からシスゴルジ体へ輸送される準備ができたことを示します。[ 4 ] ER マンノシダーゼがこの最後のグルコースの除去を触媒します。しかし、タンパク質が正しく折り畳まれていない場合、グルコース残基は除去されず、したがって糖タンパク質は小胞体から出ることができません。シャペロンタンパク質(カルネキシン/カルレティキュリン) が、折り畳まれていない、または部分的に折り畳まれたタンパク質に結合して、タンパク質の折り畳みを助けます。
次の段階では、シスゴルジ体で糖残基のさらなる付加と除去が行われます。これらの修飾は、それぞれグリコシルトランスフェラーゼとグリコシダーゼによって触媒されます。シスゴルジ体では、一連のマンノシダーゼがα-1,2結合の4つのマンノース残基の一部または全部を除去します。[ 4 ]一方、ゴルジ体の中央部では、グリコシルトランスフェラーゼがコアグリカン構造に糖残基を付加し、高マンノース型、ハイブリッド型、複合型という3つの主要なタイプのグリカンが生成されます。
成長中のグリカン鎖への糖の付加順序は、酵素の基質特異性と、分泌経路を通過する際の基質へのアクセスによって決定される。したがって、細胞内におけるこの機構の組織化は、どのグリカンが作られるかを決定する上で重要な役割を果たす。
ゴルジ酵素は、様々な種類のグリカン合成を決定する上で重要な役割を果たしている。酵素の作用順序は、ゴルジスタック内での酵素の位置に反映されている。
原核生物と古細菌にも同様のN-グリカン生合成経路が見つかっている。[ 6 ]しかし、真核生物と比較すると、真正細菌と古細菌の最終的なグリカン構造は、小胞体で作られた最初の前駆体とあまり違いがないように見える。真核生物では、元の前駆体オリゴ糖は細胞表面に向かう途中で広範囲に修飾される。[ 4 ]
N結合型糖鎖には内在的機能と外在的機能がある。[ 4 ] [ 7 ]
免疫系において、免疫細胞表面のN結合型糖鎖は、細胞の移動パターンを決定するのに役立ちます。例えば、皮膚に移動する免疫細胞は、その部位へのホーミングを促進する特定の糖鎖修飾を持っています。 [ 8 ] IgE、IgM、IgD、IgA、IgGを含む様々な免疫グロブリンの糖鎖修飾パターンは、Fcや他の免疫受容体への親和性を変化させることで、それぞれに独自の作用機序を与えます。[ 8 ] 糖鎖は、「自己」と「非自己」の識別にも関与している可能性があり、これは様々な自己免疫疾患の病態生理に関連している可能性があります。[ 8 ]
場合によっては、N-グリカンとタンパク質の相互作用により、複雑な電子効果によってタンパク質が安定化される。[ 11 ]
N結合型糖鎖修飾の変化は、関節リウマチ[ 12 ] 、1型糖尿病[ 13 ] 、クローン病[ 14 ]、癌[ 15 ] [ 16 ]など、さまざまな疾患と関連付けられています。
N結合型糖鎖修飾に関与する18個の遺伝子の変異は、さまざまな疾患を引き起こし、そのほとんどは神経系に関係している。[ 3 ] [ 16 ]
市販されている治療用タンパク質の多くは抗体であり、抗体はN結合型糖タンパク質である。例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、リツキシマブはN型糖鎖修飾を受けた治療用タンパク質である。
N結合型糖鎖修飾の重要性は、医薬品分野でますます明らかになってきている。[ 17 ]細菌や酵母のタンパク質生産システムは、高収率や低コストなどの大きな潜在的利点があるが、目的のタンパク質が糖タンパク質である場合は問題が生じる。大腸菌などのほとんどの原核生物発現システムは、翻訳後修飾を行うことができない。一方、酵母や動物細胞などの真核生物発現宿主は、異なる糖鎖修飾パターンを持つ。これらの発現宿主で生産されるタンパク質は、ヒトタンパク質と同一ではないことが多く、そのため患者に免疫原性反応を引き起こす。例えば、S.cerevisiae（酵母）は、免疫原性のある高マンノース糖鎖を生産することが多い。
CHO細胞やNS0細胞などの非ヒト哺乳類発現系は、複雑なヒト型糖鎖を付加するために必要な機構を備えています。しかし、これらの系で産生される糖鎖は、ヒトで産生される糖鎖とは異なり、N-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）とN-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）の両方で末端修飾される可能性があります。一方、ヒト細胞はN-アセチルノイラミン酸を含む糖タンパク質のみを産生します。さらに、動物細胞は、α-ガラクトース-α-1,3-ガラクトースエピトープを含む糖タンパク質を産生することもあり、 α-ガラクトースアレルギーを持つ人には、アナフィラキシーショックなどの重篤なアレルギー反応を引き起こす可能性があります。
これらの欠点は、遺伝子ノックアウトによってこれらのグリカン構造を生成する経路を排除するなど、いくつかの方法で対処されてきました。さらに、ヒトに似たN結合型グリカンを持つ治療用糖タンパク質を生成するために、他の発現系が遺伝子操作されています。これには、ピキア・パストリスなどの酵母[ 18 ]、昆虫細胞株、緑色植物[ 19 ] 、さらには細菌が含まれます。