突然変異誘発（分子生物学技術）

分子生物学において、突然変異誘発は、 DNA の突然変異を意図的に操作して、突然変異遺伝子、タンパク質、細菌株、またはその他の遺伝子組み換え生物のライブラリーを作成する重要な実験技術です。遺伝子のさまざまな構成要素、およびその調節要素と遺伝子産物は、遺伝子座、プロセス、または産物の機能を詳細に調べることができるように突然変異される可能性があります。突然変異により、興味深い特性を持つ突然変異タンパク質や、商業的に利用できる強化された機能または新しい機能を持つ突然変異タンパク質が生成される可能性があります。また、実用的な用途がある、または特定の細胞機能の分子的基礎を調査できる突然変異株が生成されることもあります。

今日、突然変異誘発の方法は数多く存在する。当初、実験室で人工的に誘発された突然変異は、紫外線照射などのメカニズムを使用して完全にランダムなものでした。ランダム突然変異誘発では、ゲノムの特定の領域や配列をターゲットにすることはできませんが、部位特異的突然変異誘発の開発により、より具体的な変更を加えることができます。2013年以降、原核生物のウイルス防御システムに基づくCRISPR / Cas9技術の開発により、生体内でのゲノムの編集または突然変異誘発が可能になりました。^[1]部位特異的突然変異誘発は、ランダム突然変異誘発が不可能な状況で有用であることが証明されています。その他の突然変異誘発技術には、コンビナトリアル突然変異誘発と挿入突然変異誘発があります。ランダムでない突然変異誘発は、DNAのクローン作成、^[2]、変異原の影響の調査、^[3]、タンパク質のエンジニアリングに使用できます。^[4]また、免疫不全患者の治療、HIVや癌などの病気の研究と治療、ベータサラセミアなどの病気の治療などの医療用途もあります。^[5]

突然変異誘発に対する初期のアプローチは、完全にランダムな突然変異を生じさせる方法に依存していました。このような方法では、細胞または生物を紫外線や変異誘発化学物質などの突然変異原にさらし、望ましい特性を持つ突然変異体を選択します。ヘルマン・ミュラーは1927年に、X線がショウジョウバエの遺伝子変異を引き起こす可能性があることを発見し、^{[6]作成した突然変異体を}遺伝学の研究に使用しました。^[7]大腸菌の場合、突然変異体は最初に紫外線にさらすことで選択され、次に寒天培地に播種されます。形成されたコロニーは次に、1つを栄養豊富な培地に、もう1つを最少培地にレプリカ播種し、特定の栄養要求性を持つ突然変異体は、最少培地で成長できないことで識別できます。同様の手順を他の種類の細胞や異なる培地で繰り返して選択することができます。

その後、興味深い特性や改善された特性を持つ変異体を選別するために、特定のタンパク質にランダムな突然変異を起こす方法が数多く開発されました。これらの方法には、オリゴヌクレオチド合成におけるドープヌクレオチドの使用、複製の忠実度を下げる、ヌクレオチド類似体を使用するなど、ヌクレオチドの誤取り込みを促進する条件でPCR反応を行う（エラーを起こしやすいPCR）ことが含まれます。 ^[8]遺伝子に偏りのない突然変異を組み込むこの方法のバリエーションは、配列飽和突然変異誘発です。^[9]次に、突然変異を含むPCR産物を発現ベクターにクローニングし、生成された突然変異タンパク質を特徴付けることができます。

動物実験では、N-エチル-N-ニトロソ尿素（ENU）などのアルキル化剤が突然変異マウスの生成に使用されています。^{[10] [11]}エチルメタンスルホン酸（EMS）も動物、植物、ウイルスの突然変異体の生成によく使用されます。^{[12] [13] [14]}

欧州連合の法律（2001/18指令）では、この種の突然変異誘発はGMOの生産に使用できるが、製品は規制の対象外であり、ラベル表示や評価は行われない。^[15]

部位特異的突然変異誘発技術が開発される前は、すべての突然変異はランダムであり、科学者は望ましい突然変異を見つけるために望ましい表現型の選択を使用しなければなりませんでした。ランダム突然変異誘発技術は、いくつの突然変異を生じさせることができるかという点で利点がありますが、ランダム突然変異誘発は単一のヌクレオチドの変化を生じさせることができますが、どのヌクレオチドが変更されるかをあまり制御できません。^[5]そのため、多くの研究者は、正確で部位特異的な方法でDNAに選択された変化を導入しようとしています。初期の試みでは、ヌクレオチドの類似体を使用し、他の化学物質が最初に局所的な点突然変異を生成するために使用されました。^[16]このような化学物質には、ATからGCへの遷移を誘発するアミノプリン^[17]、ニトロソグアニジン^{[18] 、}亜硫酸水素塩[ ^19]、およびN ⁴ -ヒドロキシシチジンはGCからATへの遷移を誘発する場合があります。^{[20] [21]}これらの技術により、特定の突然変異をタンパク質に組み込むことができます。しかし、これらの技術は、生成される突然変異体の種類に関して柔軟性がなく、また、後代の部位特異的突然変異誘発法ほど特異的ではないため、ある程度のランダム性があります。染色体上の特定の部位でのDNAの切断、新しいヌクレオチドの追加、塩基対の交換などの他の技術により、現在ではどこに突然変異が起こるかを決定することができます。^{[11] [8]}

現在の部位特異的変異の技術は、1978年に開発されたプライマー伸長技術に由来しています。このような技術では、通常、DNAポリメラーゼによるプライマー伸長反応で、あらかじめ作製された変異誘発オリゴヌクレオチドを使用します。この方法により、特定の部位での点変異、またはDNAの小さな断片の削除または挿入が可能になります。方法論の進歩により、このような変異誘発は現在では比較的単純で効率的なプロセスとなっています。^[3]

より新しく、より効率的な部位特異的突然変異誘発法が絶えず開発されています。例えば、「シームレスライゲーションクローニング抽出法」（略してSLiCE）と呼ばれる技術は、ゲノム内の特定のDNA配列のクローニングを可能にし、一度に複数のDNA断片をゲノムに挿入することができます。^[2]

部位特異的突然変異誘発により、特定の突然変異の影響を調べることができます。用途は多岐にわたります。たとえば、実験室でよく使用される化学物質に対して特定の種がどの程度感受性があるかを判断するために使用されています。実験では、部位特異的突然変異誘発を使用して、特定の化学物質の予想される突然変異を模倣しました。突然変異により特定のアミノ酸が変化し、この突然変異の影響が分析されました。^[3]

部位特異的アプローチは、アラニンスキャン突然変異誘発などの技術で体系的に実行することができ、これにより、タンパク質の構造や機能に重要な残基を特定するために、残基が体系的にアラニンに変異される。 ^[22]もう1つの包括的なアプローチは、特定の位置で1つのコドンまたはコドンセットをすべての可能なアミノ酸に置換する部位飽和突然変異誘発である。^{[23] [24]}

コンビナトリアル突然変異誘発は、個々の突然変異の付加的効果の分析に基づいて、タンパク質の複数の突然変異体を同時に設計できる部位特異的タンパク質工学技術である。^[25]これは、多数の突然変異がタンパク質機能に及ぼす組み合わせ効果を評価するための有用な方法を提供する。^[26]多数の突然変異体は、コンビナトリアル分析によって特定の特性についてスクリーニングすることができる。 [25]この技術では、DNA鎖に沿った複数の位置または短い配列を徹底的に変更して、変異タンパク質の包括的なライブラリを取得することができる。 [ ^{25 ]}有益な変異体の発生率は、突然変異誘発ライブラリを構築するためのさまざまな方法によって改善することができる。この技術への1つのアプローチは、DNA配列の一部を抽出し、目的の突然変異部位でのすべての可能な組み合わせを含む配列のライブラリで置き換えることである。挿入されたセグメントの内容には、構造的に重要な配列、免疫原性特性、または酵素機能の配列を含めることができる。タンパク質の特定部分の構造的または機能的意義を評価するために、遺伝子にランダムにセグメントを挿入することもある。^[25]

1 つ以上の塩基対の挿入によって DNA 変異が生じる現象は、挿入変異としても知られています。^[27]このような人工変異は、がん研究において、病気の発症メカニズムに関する洞察など、重要な情報を提供することができます。挿入変異の主な手段はレトロウイルスとトランスポゾンです。マウス乳がんウイルスやマウス白血病ウイルスなどのレトロウイルスは、発がんに関与する遺伝子を特定し、特定のがんの生物学的経路を理解するために使用できます。^[28]転位を受けることができる染色体セグメントであるトランスポゾンは、がん遺伝子発見の手段として、挿入変異に設計および適用できます。^[28]これらの染色体セグメントにより、挿入変異をほぼあらゆる組織に適用できると同時に、より包括的で偏りのない DNA シーケンシングが可能になります。^[28]

研究者らは、人間に使用できる挿入変異誘発の 4 つのメカニズムを発見しました。最初のメカニズムはエンハンサー挿入と呼ばれます。エンハンサーは、特定の遺伝子のプロモーターと相互作用することで、その遺伝子の転写を促進します。この特定のメカニズムは、骨髄を必要とする重度の免疫不全患者を助けるために最初に使用されました。次に、エンハンサーを運ぶガンマレトロウイルスが患者に挿入されました。2 番目のメカニズムはプロモーター挿入と呼ばれます。プロモーターは、翻訳を開始するために必要な特定の配列を細胞に提供します。プロモーター挿入は、研究者が HIV ウイルスについてさらに詳しく知るのに役立ちました。3 番目のメカニズムは遺伝子不活性化です。遺伝子不活性化の例として、挿入変異誘発を使用して、白血病患者の T 細胞のゲノムを破壊するレトロウイルスを挿入し、CAR と呼ばれる特定の抗原を与えて、T 細胞が癌細胞を標的にできるようにすることが挙げられます。最後のメカニズムは、mRNA 3' 末端置換と呼ばれます。遺伝子は時折、点突然変異を起こし、赤血球の機能を妨げるベータサラセミアを引き起こします。この問題を解決するために、赤血球の正しい遺伝子配列を導入し、置換を行います。^[5]

相同組換えは、生物に特定の突然変異を起こすために利用することができる。改変する遺伝子に類似したDNA配列を含むベクターを細胞に導入し、組換えのプロセスによって染色体中の標的遺伝子を置き換える。この方法は、例えばノックアウトマウスの作製に使用されるように、突然変異を導入したり遺伝子をノックアウトしたりするために使用できる。^[29]

2013年以来、 CRISPR -Cas9技術の開発により、多種多様な生物のゲノムにさまざまな種類の変異を効率的に導入することが可能になりました。この方法は、トランスポゾン挿入部位を必要とせず、マーカーを残さず、その効率性とシンプルさから、ゲノム編集の好ましい方法となっています。^{[30] [31]}

DNAオリゴヌクレオチド合成のコストが下がるにつれて、完全な遺伝子の人工合成は、遺伝子に突然変異を導入するための現実的な方法になりました。この方法は、遺伝子のコドン使用を完全に再設計して特定の生物に最適化するなど、複数の部位で広範な突然変異を可能にします。^[32]

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