DNAシャッフル

DNAシャッフリングは分子育種とも呼ばれ、突然変異遺伝子を生成して指向性進化を実現し、 DNAライブラリのサイズを急速に増やすための試験管内ランダム組換え法である。 ^{[1] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] DNAシャッフリングを実現するには、}相同組換えまたはDNA配列の類似性を利用する分子育種、共通の制限部位を利用する制限酵素、ヘアピンを使用する非相同ランダム組換えの3つの手順がある。^[1]これらの技術ではいずれも、親遺伝子を断片化してから組換えを行う。^{[1] [4]}

DNA シャッフリングは、部位特異的突然変異誘発とは対照的にランダムな組み換えを利用して、耐熱性や高活性など、親遺伝子にコード化された望ましい特性のユニークな属性または組み合わせを持つタンパク質を生成します。 ^{[1] [8]} DNA シャッフリングによる新規タンパク質の生成の可能性は、点突然変異、挿入および削除、および DNA シャッフリングの違いを示す右の図に例示されています。^[1]具体的には、この図は、2 つの親遺伝子に対する DNA シャッフリングの使用を示しており、これにより、各親遺伝子からの配列のランダムな組み合わせを持つ組み換えタンパク質の生成が可能になります。^[1]これは、 1 つのヌクレオチドが変更、挿入、または削除された点突然変異や、ヌクレオチドの配列がそれぞれ追加または削除された挿入または削除とは異なります。^{[1] [2]}ランダムな組み換えの結果、DNA シャッフリングは、親遺伝子から派生した新しい性質または複数の有利な特徴を持つタンパク質を生成することができます。^{[1] [4]}

1994年、ウィレム・PC・ステマーはDNAシャッフルに関する最初の論文を発表しました。^[7]この技術の導入以来、DNAシャッフルはタンパク質や低分子医薬品、バイオレメディエーション、ワクチン、遺伝子治療、進化したウイルスに応用されてきました。^{[3] [10] [11] [12]} DNAシャッフルと同様の結果をもたらす他の技術には、一過性テンプレート上のランダムキメラ生成（RACHITT）、ランダムプリンティングin vitro組換え（RPR）、およびスタッガード伸長プロセス（StEP）があります。^{[4] [7] [13]}  

分子育種による DNA シャッフルは、1994 年に Willem PC Stemmer によって初めて報告されました。^{[1] [7]彼は、}ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅されたβ-ラクタマーゼ遺伝子を、DNA をランダムに切断するDNase I を使用して断片化することから始めました。^{[14] [15]次に、}プライマーを使用しない修正 PCR 反応を完了し、相同断片または類似の配列を持つ断片のアニーリングを実現しました。^[14]最後に、これらの断片を PCR で増幅しました。^{[14] Stemmer は、DNA シャッフルを}バッククロスと組み合わせて使用​​すると、必須でない突然変異が排除され、抗生物質セフォタキシムの生産が増加すると報告しました。^[14]彼はまた、 DNA シャッフルによる分子進化の可能性を強調しました。 ^[16]具体的には、この技術がタンパク質の改変に使用できることを示唆しました。^[16]    

DNAシャッフリングはその後、ハイブリッド遺伝子やキメラ遺伝子のライブラリーを生成するために応用され、DNAシャッフリングにおける関連遺伝子の使用として定義されるファミリーシャッフリングに影響を与えた。^{[17] [18] [19]}さらに、DNAシャッフリングはタンパク質や低分子医薬品、バイオレメディエーション、遺伝子治療、ワクチン、進化ウイルスにも応用されている。^{[3] [10] [11] [12] [20]}

まず、DNase Iを使用して、親遺伝子のセットを10〜50 bpから1 kbpを超える範囲の二本鎖DNAセグメントに断片化します。^{[4] [16]}次に、プライマーなしのPCRが行われます。^[14] PCRでは、十分に重複する配列を持つDNA断片が互いにアニールし、DNAポリメラーゼによって伸長します。^{[1] [4] [5] [7] [14] [16] [21]} PCR伸長は、高い類似性のDNA配列がない限り発生しません。^[1] DNAシャッフリングで合成される配列に影響を与える重要な要因は、DNAポリメラーゼ、塩濃度、およびアニーリング温度です。^[10]たとえば、 20サイクルのPCRで1 kbpの断片を増幅するためにTaqポリメラーゼを使用すると、33％から98％の生成物に1つ以上の変異が含まれます。^[21]

PCR伸長の複数サイクルを使用して断片を増幅することができる。^{[1] [4] [5] [7] [14] [16] [21]}伸長した断片の末端に相補的となるように設計されたプライマーを追加して、別のPCRで配列をさらに増幅する。^{[1] [14] [21]プライマーは、}クローニングベクターへのライゲーションに必要な制限酵素認識部位の配列など、5'末端に追加の配列が追加されるように選択することができる。^{[1] [14]}

親遺伝子の一部を再結合して、ユニークな特性を持つハイブリッドまたはキメラ形態を生成することが可能であり、これがDNAシャッフリングと呼ばれる。^[22]分子育種の欠点は、配列間の類似性が必要であることであり、これがDNAシャッフリングのための他の手順の開発につながった。^[1]

制限酵素は親遺伝子を断片化するために使用されます。^{[1] [21]}次に、断片は DNAリガーゼを使用して連結されます。^[1]たとえば、2 つの親遺伝子が 3 つの制限部位を持っている場合、14 の異なる完全長遺伝子ハイブリッドを作成できます。^[1]固有の完全長ハイブリッドの数は、3 つの制限部位を持つ遺伝子が 4 つの断片に分割できるという事実によって決まります。^[1]したがって、4 つの位置のそれぞれに 2 つのオプションがあり、2 つの親遺伝子を再作成する組み合わせを除くと、2 ⁴ - 2 = 14 の異なる完全長ハイブリッド遺伝子が生成されます。^[1]

制限酵素によるDNAシャッフルと分子育種の主な違いは、分子育種では鎖のアニーリングに配列の相同性、伸長にPCRを利用するのに対し、制限酵素を使用すると連結可能な断片末端が作られる点である。^[1]制限酵素を使用する主な利点は、組み換えイベントの数を制御できることとPCR増幅が不要であることである。^{[1] [23]}主な欠点は、共通の制限酵素部位が必要であることである。^[1]

10～50 bpから1 kbを超えるセグメントを生成するために、DNase Iが利用される。^{[4] [16] [24]}断片の末端は、T4 DNAポリメラーゼを加えることで平滑にされる。^{[1] [24]断片を平滑にすることは、互換性のない}粘着末端、つまりオーバーハングが末端の結合を妨げるため、 断片を結合するために重要である。 ^{[1] [25] [26]}次に、特定の制限部位を持つヘアピンを断片の混合物に加える。^{[1] [24]}次に、T4 DNAリガーゼを使用して断片を連結し、拡張された配列を形成する。^{[1] [24]}ヘアピンを断片に連結すると、それ以上の断片の追加を防ぐことで、拡張された配列の長さが制限される。^[1]最後に、ヘアピンループを除去するために、制限酵素が利用される。^{[1] [24]}

非相同ランダム組換えは分子育種とは異なり、連結された配列の相同性は必要ではないという利点がある。^[1]しかし、このプロセスでは断片がランダムに組み換えられるため、組み換えられた DNA 配列の大部分が望ましい特性を持たない可能性があり、これが欠点である。^[1]非相同ランダム組換えは、親遺伝子上の共通の制限酵素部位は必要なく、ヘアピンの使用が必要であるという点で、DNA シャッフルのための制限酵素の使用とも異なり、それぞれ制限酵素の使用に対する非相同ランダム組換えの利点と欠点を示している。^[1]

DNAシャッフリングは遺伝子の組み換えを可能にするため、タンパク質の活性を高めることができる。^{[3] [20]例えば、DNAシャッフリングは、マウスおよびヒト細胞に対するファージディスプレイ組換え}インターフェロンの効力を高めるために使用されている。^[3]さらに、分子育種によるDNAシャッフリングにより、全細胞蛍光の標準よりも45倍大きな信号が得られたことから、緑色蛍光タンパク質（GFP）の改良が達成された。 ^[20]さらに、多様な遺伝子の合成により、新しい特性を持つタンパク質が生成されることもある。^[1]そのため、DNAシャッフリングは化学物質を解毒するタンパク質の開発に使用されている。^{[3] [27]例えば、分子育種によるDNAシャッフリングの相同組み換え法は、}アトラジンやヒ酸塩 の解毒を高めるために利用されている。^{[3] [27]}  

DNAシャッフリングは生物学的汚染物質の分解を改善するためにも使用されている。^{[12] [28]具体的には、分子育種によるDNAシャッフリングを利用して、有毒な}エポキシド中間体の影響を受けにくい、発がん性物質であるトリクロロエチレン（TCE）のバイオレメディエーションのための組み換え大腸菌株が作成された。^{[12] [21] [28]}

DNAシャッフリングによる望ましい組み換え体を選択する能力は、免疫原性、ワクチン生産、安定性、および複数の病原体株に対する交差反応性の改善に重点を置いた感染症に対するワクチン候補を強化するためのスクリーニング戦略と組み合わせて使用​​​​されてきました。 ^{[3] [10]}熱帯熱マラリア原虫、デングウイルス、脳炎アルファウイルス（VEEV、WEEV、EEEVを含む）、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）、およびB型肝炎ウイルス（HBV）に対するいくつかのワクチン候補が研究されています。^[10]   

ヒト遺伝子治療には、高純度、高力価、安定性が求められる。^[11] DNAシャッフリングにより、これらの特性を持つレトロウイルスベクターの製造が可能になる。^[11]例えば、分子育種によるDNAシャッフリングを6つのエコトロピック マウス白血病ウイルス（MLV）株に適用した結果、組換えレトロウイルスの大規模なライブラリが構築され、安定性が向上した複数のクローンが特定された。^[11]さらに、分子育種によるDNAシャッフリングを複数の親アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターに適用することで、1000万個のキメラのライブラリが生成された。^[29]得られた有利な特性には、ヒト静脈内免疫グロブリン（IVIG）に対する耐性の向上や、新規ウイルスの細胞向性の発現などがある。 ^[29]   

DNAシャッフルはランダム組換えに有用な技術となっているが、RACHITT、RPR、StEPなどの他の方法もこの目的のために開発されている。^{[4] [13]}以下は、これらの他の組換え方法の利点と欠点である。^{[4] [7] [13]}

RACHITTでは、一本鎖（ss）親遺伝子の断片がssテンプレートにアニールされるため、ミスマッチが減少するという利点があります。^[13]さらに、RACHIITでは、配列類似性の低い遺伝子の組み換えが可能です。^[7]しかし、大きな欠点は、親遺伝子のss断片とssテンプレートを準備する必要があることです。^{[7] [13]}

RPRはランダムプライマーを使用する。^[30]これらのランダムプライマーはテンプレートDNAにアニールされ、クレノウフラグメントによって伸長される。^[30]次に、テンプレートが除去され、PCRと同様のプロセスで相同性によってフラグメントが組み立てられる。^[30]主な利点としては、ssテンプレートの使用により親遺伝子の必要性が少なくなり、ミスプライミングやミスインテグレーションによって配列の多様性が増加するなどが挙げられる。^{[7] [30]} RPRの欠点の1つは、テンプレートの準備である。^[30]  

StEPでは、プライマーのテンプレートへのアニーリングとポリメラーゼによる伸長の短いサイクルを利用して全長配列を生成します。^{[31] [32]} StEPの主な利点は、方法の単純さと断片の精製が不要なことです。^{[7] [13]} StEPの欠点は、時間がかかり、配列の相同性が必要であることです。^{[7] [13]}

• SCOPE（タンパク質工学）