試験管内区画化

インビトロ区画化( IVC ) は、エマルジョンベースの技術で、インビトロで細胞のような区画を生成します。これらの区画は、それぞれに 1 つの遺伝子しか含まれないように設計されています。遺伝子が転写および/または翻訳されると、その産物 ( RNAおよび/またはタンパク質) は、区画内のエンコード遺伝子とともに「捕捉」されます。遺伝子型( DNA ) と表現型(RNA、タンパク質) を結合することにより、区画化によって表現型の選択と進化が可能になります。

インビトロ区画化法は、ダン・タウフィックとアンドリュー・グリフィスによって初めて開発されました。^[1]ダーウィンの進化は遺伝子型と表現型の関連に依存しているという考えに基づいて、タウフィックとグリフィスたちは、遺伝子型と表現型を関連付けることができる細胞区画を模倣する油中水型（w/o）エマルジョンの水性区画を設計しました。細胞のような区画のエマルジョンは、界面活性剤を含む撹拌された鉱油にインビトロ転写/翻訳反応混合物を加えることによって形成されました。レーザー回折によって測定された平均液滴直径は2.6 μmでした。概念実証として、タウフィックとグリフィスたちは、異なる酵素folAをコードする遺伝子の10 ⁷倍過剰の存在下で、 HaeIII DNAメチルトランスフェラーゼ（M.HaeIII）をコードする遺伝子を含むDNA配列のプールを使用する選択実験を設計しました。各 DNA 配列の 3' はHaeIII認識部位を含むように意図的に設計されており、発現したメチルトランスフェラーゼが存在するとメチル化され、制限酵素による消化に耐性を持つようになります。エンドヌクレアーゼによる消化を生き延びる DNA 配列を選択することにより、Tawfik と Griffiths は、最初の選択ラウンドで M.HaeIII 遺伝子が folA 遺伝子の少なくとも 1000 倍に増加することを発見しました。

油中水（w/o）エマルジョンは、界面活性剤の助けを借りて水相と油相を混合することによって作られます。一般的なIVCエマルジョンは、最初に攪拌して油界面活性剤混合物を生成し、次に油界面活性剤混合物に水相を徐々に追加することによって形成されます。安定したエマルジョン形成には、HLB（親水性親油性バランス）と低HLB界面活性剤の混合物が必要です。^[3]油界面活性剤混合物を生成するために使用される界面活性剤の組み合わせには、鉱油/ 0.5％Tween 80 / 4.5％Span 80 /デオキシコール酸ナトリウム^[1]や、より熱安定性のある軽質鉱油/ 0.4％Tween 80 / 4.5％Span 80 / 0.05％Triton X-100があります。^[4]転写および/または翻訳成分を含む水相を油界面活性剤にゆっくりと追加し、均質化、攪拌、または手動押し出し装置を使用することでw/oの形成を促進します。

エマルジョンの品質は、光学顕微鏡法や動的光散乱法によって判定できます。エマルジョンは非常に多様であり、均質化速度を上げると、サイズ分布が狭い小さな液滴が生成されます。ただし、13,500 rpmを超える速度では、転写レベルで酵素活性が大幅に低下する傾向があるため、均質化速度を制御する必要があります。最も広く使用されているエマルジョン形成では、平均直径が2〜3μm、平均容量が約5フェムトリットル、つまりエマルジョン1mlあたり10 ^{10の水性液滴が得られます。 [5]}遺伝子と液滴の比率は、統計的にほとんどの液滴に遺伝子が1つしか含まれないように設計されています。

IVC は、現在ではマイクロスケールで実行できる大規模技術の小型化を可能にし、これにはin vitro 転写および翻訳(IVTT) 結合実験も含まれます。転写と翻訳を合理化して統合することで、高速で高度に制御可能な実験設計が可能になります。^{[6] [7] [8] IVTT は、}液滴ベースのマイクロ流体を利用することで、バルクエマルジョンでもマイクロ液滴でも実行できます。ピコリットルからフェムトリットル規模の液滴であるマイクロ液滴は、単一の DNA 分子容器として効果的に使用されています。^{[9] [10]}この液滴技術により、単一の実験セットアップで多くの異なる選択圧による高スループット分析が可能になります。^{[6] [10]}目的のタンパク質の過剰発現が宿主細胞に有毒で、転写および翻訳メカニズムの有用性を最小限に抑える場合、マイクロ液滴での IVTT が好まれます。^[11]

IVC は、細菌細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球 (RRL) 抽出物を転写と翻訳に使用してきました。また、翻訳成分を個別に精製し、後で組み合わせる PURE などの細菌再構成翻訳システムを使用することもできます。真核生物または複合タンパク質を発現する場合は、小麦胚芽抽出物や、より優れた代替品である RRL 抽出物などの真核生物翻訳システムを使用することが望ましいです。転写と翻訳に RRL を使用するには、翻訳を無効にする従来のエマルジョン処方は使用できません。代わりに、新しいエマルジョン処方: 4% Abil EM90 / 軽質鉱油が開発され、ルシフェラーゼとヒトテロメラーゼの発現に機能することが実証されました。^[12]

液滴内で転写および/または翻訳が完了すると、鉱物油と界面活性剤を除去する連続ステップによってエマルジョンが破壊され、その後の選択が可能になります。この段階では、遺伝子産物が不均一な分子集団内で自由に浮遊するため、各遺伝子産物をエンコード遺伝子まで「追跡」する方法が重要です。各表現型をその遺伝子型まで追跡するには、主に 3 つのアプローチがあります。^[13]最初の方法は、各 DNA 分子にビオチン基とストレプトアビジンの追加コード配列を付加することです(STABLE ディスプレイ)。^[14]新しく形成されたすべてのタンパク質/ペプチドは、ストレプトアビジン分子と融合し、ビオチン化されたコード配列に結合します。改良版では、DNA 分子の末端に 2 つのビオチン分子を付加して、 DNA 分子とストレプトアビジン融合ペプチド間の親和性を高め、低 GC 含有量の合成ストレプトアビジン遺伝子を使用して、PCR 増幅中の効率と特異性を高めました。^[15] 2 番目の方法は、DNA とタンパク質を共有結合させることです。 2 つの戦略が実証されています。1 つ目は、M.HaeIII 融合タンパク質を形成することです。^[16]発現された各タンパク質/ポリペプチドは、Hae III DNA メチルトランスフェラーゼ ドメインと融合され、配列 5′-GGC*-3′ (C* は 5-フルオロ-2 デオキシシチジン) を含む DNA フラグメントに共有結合することができます。2 つ目の戦略は、VirD2 酵素のモノマー変異体を使用することです。^[17]タンパク質/ペプチドがアグロバクテリウム タンパク質 VirD2 と融合して発現されると、VirD2 T 境界認識配列を含む一本鎖オーバーハングを持つ DNA コード配列に結合します。3 つ目の方法は、ビーズを介して表現型と遺伝子型をリンクすることです。^[18]使用するビーズは、ビオチン化 DNA の結合を可能にするためにストレプトアビジンでコーティングされ、さらに、ビーズは、タンパク質/ペプチドと融合して発現される 親和性タグの同族結合パートナーも表示します。

選択する表現型に応じて、異なる選択戦略が使用されます。選択戦略は、結合の選択、触媒の選択、および調節の選択という3つの主要なカテゴリに分けられます。^[19]選択する表現型は、RNAからペプチド、タンパク質まで多岐にわたります。結合を選択することで、最も一般的に進化する表現型は、特定の抗体またはDNA分子に選択的な親和性を持つペプチド/タンパク質です。一例は、 SeppらによるジンクフィンガーDNAに親和性を持つタンパク質の選択です。 ^[20]触媒タンパク質/RNAを選択することで、通常、新しいまたは改善された酵素特性を持つ新しい変異体が分離されます。たとえば、トランスリガーゼ活性を持つ新しいリボザイム変異体が選択され、複数のターンオーバーを示しました。^[21]調節を選択することで、コリシンE7 DNaseのタンパク質阻害剤など、DNAヌクレアーゼの阻害剤を選択できます。^[22]

他のin vitroディスプレイ技術と比較して、IVC には 2 つの大きな利点があります。1 つ目の利点は、液滴内の反応を制御できることです。疎水性成分と親水性成分は、液滴の化学的完全性を損なうことなく段階的に各液滴に送達できるため、何をいつ追加するかを制御することで、各液滴内の反応を制御できます。さらに、実行する反応の性質に応じて、各液滴の pH を変更することもできます。最近では、光ケージ基質が使用され、反応への関与は光活性化によって制御されました。^[19] 2 つ目の利点は、IVC によって触媒分子を選択できることです。例として、Griffiths らは、抗産物抗体とフローサイトメトリーを使用してそれぞれ産物の形成と量を検出することで、より高い K _{cat を持つ}ホスホトリエステラーゼ変異体を選択することができました。^[23]

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