バイオ脱硫

バイオ脱硫とは、微生物やその酵素を利用して原油から硫黄を除去するプロセスである。^[1]

原油には硫黄が含まれており、硫黄は炭素と水素に次いで最も豊富な元素です。^[2]原油に含まれる硫黄の量は、その供給源に応じて0.05～10％の範囲になります。^{[3]したがって、硫黄濃度が0.5％未満または0.5％を超えると、油は}甘口または酸口に分類されます。^[4]

原油を燃焼させると、大気中に硫黄酸化物（SO _x）が放出されます。これは公衆衛生に有害であり、大気汚染や酸性雨などの深刻な環境影響の一因となります。^{[2] [3]}さらに、原油中の硫黄含有量は、機器の腐食や貴金属触媒の被毒を促進するため、製油所にとって大きな問題です。^[5]どの油田でも硫黄の含有量は高すぎるため、ガソリン、ディーゼル、ジェット燃料などの化石燃料は、有機硫黄化合物を除去する前処理を行わずに燃焼エンジンで使用することはできません。

原油の燃焼によって引き起こされる有害な健康および環境影響の主な原因の1つを軽減するには、原油中の硫黄濃度の低減が必要となります。この意味で、欧州連合はディーゼル燃料の硫黄含有量を10 ppm未満に低減する措置を講じており、^[6]米国はディーゼル燃料とガソリンの硫黄含有量を最大15 ppmに制限する取り組みを行っています。^{[7]石油燃料中の硫黄化合物の低減は、}脱硫と呼ばれるプロセスによって達成できます。^[8]脱硫に使用される方法には、水素化脱硫、^[9] 酸化脱硫、^[10]抽出脱硫、^[11]イオン液体による抽出などがあります。^[12]

従来の脱硫法は硫黄含有量を減らすのに効果的であるにもかかわらず、原油精製プロセスに関連するCO2排出量のかなりの部分を依然として占めており、年間最大9000トンを排出しています。 ^{[13]さらに、これらのプロセスは通常大量のエネルギーを必要とし}_、それを採用する産業に莫大なコストを伴います。従来の脱硫法よりも環境に優しく、補完的な代替プロセスはバイオ脱硫です。^[3]

硫黄依存性細菌が存在し、そのライフサイクル（成長過程または代謝過程）において硫黄含有化合物中の硫黄を利用して、硫黄含有量の少ない/全くない分子を生成することが観察されている。^[14]特に、ヘテロ芳香族化合物、すなわちチオフェンおよびその誘導体は、細菌の重要な基質を構成することが観察されている。^{[15] [16]}

バイオ脱硫は、硫黄除去の魅力的な代替手段であり、特に硫黄複素環化合物が豊富に含まれる原油留分ではその効果が顕著です。^{[17] [3]}現在までのところ、産業応用に向けたパイロット実験では、細菌全体のシステムを利用してきました。これは、バイオ脱硫には、硫黄原子または分子状酸素との酸化還元反応に関与するさまざまな酵素と大量の補因子による連続的な反応カスケードが含まれるためです。 ^{[18]しかし、}酵素効率が全体的に低いこと、生成物フィードバック阻害メカニズムと毒性があること、または細菌の長期増殖に不適切な条件であることなどから、産業用セットアップに求められる拡張性が欠けていました。^[14]無細胞組換え酵素が望ましいですが、既知の実装は、全細胞酵素の効率をはるかに下回っています。^[19]

細菌が硫黄含有化合物から硫黄を除去する主な経路は、環破壊経路と硫黄特異的経路の 2 つです。環破壊経路は、炭素-炭素結合を選択的に切断して周囲の水性環境に可溶性の小さな有機硫化物を放出する経路ですが、硫黄特異的経路は、硫黄の酸化還元反応を連続的に利用して、硫黄を硫化物または亜硫酸アニオンとして副産物として放出します。^[3]そのため、後者は、特に酸性原油留分に豊富に含まれる硫黄複素環の脱硫において、高カロリーの硫黄を含まない化合物を生成する非常に有望な経路であると考えられてきました。^[1]

最も研究されている環破壊経路は Kodama 経路であり、Pseudomonas abikonensisとPseudomonas jijaniで最初に特定されました。^[21]この経路は、次の 4 つの主なステップで構成されます。i ) NADH 依存性ジオキシゲナーゼによる芳香族環の 1 つの炭素の連続的な水酸化、それに続くii) NAD ⁺補因子による環の脱水素、さらにiii)酸素化による環切断とピルビル分岐の形成、最後にiv)ピルビル置換基の加水分解によるピルビン酸と基質の残留物の放出です。[ 20 ] ^{[ 22]}この経路の最終生成物は依然として水溶性の硫黄化合物であるため、この経路は、特に石油産業では、工業用途の魅力的な経路としてしばしば無視されてきました。^[23] 最もよく研​​究されている硫黄特異的経路は4S経路であり、最初に細菌ロドコッカス・エリスロポリス（IGTS8株）で発見されました^[1]。この経路は、ジベンゾチオフェンおよび誘導体から硫黄を3つの段階で除去することが観察されました： i）フラビン依存性モノオキシゲナーゼによる硫黄の二重酸化（スルホキシドとスルホンへの） 、続いて  ii） 2番目のフラビン依存性モノオキシゲナーゼによる炭素-硫黄結合の切断、およびiii）2-ヒドロキシビフェニルと亜硫酸塩が生成される脱スルフィネーション反応。^[24]このプロセスには合計4つの酵素が必要です。そのうち3つはdszABC遺伝子にコードされており（フラビン依存性モノオキシゲナーゼDszAとDszC、およびデスルフィナーゼDszB）、4番目の染色体にはDszDという酵素がコードされています。DszDはDszAとDszCに必要なフラビンモノヌクレオチド補因子の再生と供給を担っています。^{[25] [26]}

また、一部の嫌気性細菌は、硫黄に特異的な代替経路を使用して硫化水素を生成することが観察されている。^[27]しかし、現在までに、ビチューメン、減圧軽油、脱アスファルト油などの画分の脱硫は観察されていない^[28]

4S経路は、ジベンゾチオフェン（DBT）を2-ヒドロキシビフェニルと亜硫酸に変換する酸化脱硫の硫黄特異的代謝経路です。合計4つのNADH分子（DszDがFMNH ₂を生成するために3つ、DszAのFMN酸化物副産物を再生するために4つ目）と3つの酸素分子を使用し、副産物としてNAD ⁺と水を生成します。^[26]

DszCは、経路に2段階の連続したステップで介入する最初の酵素であり、DBTを最初にDBT-スルホキシドに、次にDBT-スルホンに二重酸化する反応を触媒します。この酵素は、DszDによって供給される補因子としてFMNH _{2と分子状}酸素を必要とします。そのため、この酵素の効率は、DszDの活性と環境の酸素化に依存します。DszCによって触媒される反応には、1) 分子状酸素の活性化によるヒドロペルオキシフラビン中間体（C4aOOH）の形成、2) DBTからDBTOへの酸化、3) FMNの脱水という3つの段階があります。^[29] DszCは、経路内で2番目に効率の悪い酵素であり、k _catが1.6 ± 0.3 min ⁻¹と特に低い^[24]また、主にDszAとDszBの産物であるHPBSと2-HBPによって引き起こされるフィードバック阻害の影響も深刻であり、^[24]そのため、酵素工学による最適化の対象となっている。

DszA は経路の 3 番目のステップを担当します。最初の炭素硫黄結合切断を触媒し、DBT スルホンを 2-ヒドロキシビフェニル-2-スルフィネートに変換します。DszC と同様に、DszA も触媒サイクルに DszD によって提供される FMNH ₂と分子状酸素を必要とします。それでも、DszA の反応速度は DszC の約 7 倍です。ただし、DszC と同様に、経路の最終生成物である 2-HBP によるフィードバック阻害を受けます。

最後に、デスルフィナーゼ（DszB）が2-ヒドロキシビフェニル-2-スルフィネートの残りの炭素-硫黄結合を切断し、2段階のメカニズムで硫黄を含まない2-ヒドロキシビフェニルに変換します。最初の律速段階では、2-ヒドロキシビフェニル-2-スルフィネートは求電子炭素のCys27によってプロトン化され、炭素-硫黄結合が切断され、SO ₂が置換されます。2番目の段階では、水分子がCys27によって脱プロトン化され、続いてSO _2への水酸化物攻撃が行われ、HSO ₃ ^{- が}形成されます。^[30] DszBはこの経路で最も効率の悪い酵素であるため、タンパク質工学による強化の魅力的なターゲットとなっています。^[24]

NADH-FMN酸化還元酵素（DszD）は、2段階のメカニズムでNADHをNAD ⁺に酸化することにより、DszCおよびDszAによって触媒される反応に必要なFMNH _{2補因子を再生します。最初のステップは、NADHの}ニコチンアミド部分から酸化されたFMNのイソアロキサジン部分の中心窒素への水素化物転移に対応し、FMNHを形成します。2番目のステップでは、水分子がFMNHのN1原子をプロトン化してFMNH _2を生成します。^[31]

野生型4S経路酵素の脱硫 率は、産業分野で実行可能な応用に達成する必要がある率と比較すると低い。このバイオ脱硫法を効率的に適用するには、経路全体の速度を500倍に増加させる必要がある。^[32]

4S酵素の触媒効率と安定性の欠如に対処するために適用されてきたアプローチには、指向進化、合理的設計、または両方の戦略の組み合わせなどがあります。 4S経路のこれまでの最良の改善は、ロドコッカス 株を改変dszオペロン（DszA、DszB、およびDszCをコード）をコードするプラスミドで形質転換する指向進化アプローチによって得られました。 DBTが唯一の硫黄源である培地で40回の継代培養を行った後、改変されたロドコッカス株は35倍の改善を示しました。^[33]

DszC の強力なフィードバック阻害は、指向性進化と合理的設計アプローチの組み合わせによっても解決され、4S 経路産物であるHBPに対して DszC を脱感作することができました。DszC A101K変異体を発現する細菌株は、野生型株に比べて高い活性を示しました。さらに、 HBP をタンパク質にドッキングすると、HBP が Trp327 と π 相互作用を形成し、DszC を阻害することが明らかになりました。A101K/W327C (AKWC) 二重変異体は、低 HBP 濃度に対して脱感作されることが明らかになり、AKWC DszC を発現する細菌株は野生型株よりも 14 倍効率的でした。^[34]

この経路の最終酵素であるDszBも、回転率が1.7 ± 0.2 min ⁻¹と最も遅い酵素の一つであり、4S経路の大きなボトルネックとなっている。計算的合理的設計アプローチにより、 DszB反応機構中に活性部位で起こる電荷移動を加速し、反応の活性化エネルギーを減らし、潜在的に回転率を高めることができる一連の変異が決定された。^[30]

DszBの触媒効率と熱安定性は実験的変異誘発アプローチでも検討され、Y63F/Q65H二重変異体は触媒効率を損なうことなく酵素の熱安定性の増加を明らかにした。^[35]

DszDはThr62残基の速度増強変異の対象にもなっている。Thr62をAsnとAla残基に変異させると、その活性はそれぞれ5倍と7倍に増加した。^[36]

計算研究により、DszD配列の位置62の置換は、 NADHからFADへの水素移動反応の活性化エネルギーに大きな影響を与えることが実証されました。Asp残基によるThr62の変異は、Aspの負電荷によって誘導される安定化効果により、この位置のすべての可能な変異体の中で最も低い活性化エネルギーを返します。^[37]

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