制限酵素

制限酵素、制限エンドヌクレアーゼ、REase、ENase、または制限酵素は、分子内の制限部位と呼ばれる特定の認識部位またはその近くでDNAを断片に切断する酵素です。^{[1] [2] [3]制限酵素は、より広範な}エンドヌクレアーゼ酵素グループ の1つのクラスです。制限酵素は一般的に5つのタイプに分類され、構造が異なり、DNA基質を認識部位で切断するか、認識部位と切断部位が互いに離れているかどうかが異なります。DNAを切断するために、すべての制限酵素は、DNA二重らせんの各糖リン酸骨格（つまり各鎖）を1回ずつ、計2回切断します。

これらの酵素は細菌や古細菌に存在し、侵入するウイルスに対する防御機構として機能する。^{[4] [5]}原核生物の内部では、制限酵素が制限消化と呼ばれるプロセスで外来DNAを選択的に切断する。一方、宿主DNAは原核生物DNAを修飾して切断を阻止する修飾酵素（メチルトランスフェラーゼ）によって保護される。これら2つのプロセスが組み合わさって制限修飾システムが形成される。^[6]

3,600種類以上の制限酵素が知られており、250種類以上の異なる特異性を持っています。^[7]このうち3,000種類以上が詳細に研究されており、800種類以上が市販されています。^[8]これらの酵素は研究室でのDNA修飾に日常的に使用されており、分子クローニングにおいて重要なツールとなっています。^{[9] [10] [11]}

制限酵素という用語は、細菌に感染するウイルスであるλファージと、そのような細菌ファージまたはバクテリオファージの宿主制御による制限および改変の現象の研究に由来しています。^[12]この現象は、1950年代初頭にサルバドール・ルリア、ジャン・ヴァイグル、ジュゼッペ・ベルターニの研究室で行われた研究で初めて特定されました。 ^{[13] [14]ある}大腸菌株、例えばE. coli C ではよく増殖できるバクテリオファージλが、別の株、例えばE. coli Kで増殖すると、その収量が大幅に、3～5桁も低下する可能性があることがわかりました。この例ではE. coli Kである宿主細胞は制限宿主として知られており、ファージλの生物学的活性を低下させる能力があるようです。ファージが1つの株に定着すると、そのファージの増殖能力は他の株でも制限されるようになる。1960年代に、ヴェルナー・アーバーとマシュー・メセルソンの研究室で行われた研究で、この制限はファージDNAの酵素切断によって引き起こされることが示され、関与する酵素は制限酵素と名付けられた。^{[4] [15] [16] [17]}

アーバーとメセルソンが研究した制限酵素はI型制限酵素で、認識部位からランダムにDNAを切断する。^[18] 1970年に、ハミルトン・O・スミス、トーマス・ケリー、ケント・ウィルコックスは、インフルエンザ菌から最初のII型制限酵素HindIIを単離し、特徴を明らかにした。^{[19] [20]}このタイプの制限酵素は、認識配列の部位でDNAを切断するため実験室での作業に便利であり、分子生物学のツールとして最も一般的に使用されている。^[21]その後、ダニエル・ネイサンズとキャスリーン・ダナは、制限酵素によるサルウイルス40 （SV40）DNAの切断により、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分離できる特定の断片が生成されることを示し、制限酵素がDNAのマッピングにも使用できることを示^[22]制限酵素の発見と特性評価に関する研究により、1978年のノーベル生理学・医学賞はヴェルナー・アーバー、ダニエル・ネイサンズ、ハミルトン・O・スミスに授与されました。^[23]制限酵素の発見によりDNAの操作が可能になり、糖尿病患者が使用するヒトインスリンなどのタンパク質の大規模生産を可能にするなど、多くの用途を持つ組み換えDNA技術の開発につながりました。^{[13] [24]}

制限酵素は共通の祖先から進化し、水平遺伝子伝播によって広く普及したと考えられます。^{[25] [26]}さらに、制限エンドヌクレアーゼが利己的な遺伝要素として進化したという証拠が増えています。^[27]

制限酵素は特定のヌクレオチド配列^[2]を認識し、DNAに二本鎖切断を生成します。認識配列は、認識部位の塩基数（通常は4〜8塩基）によって分類することもできます。また、配列内の塩基数によって、任意のゲノム内でその部位が偶然に出現する頻度が決まります。たとえば、4塩基対配列は理論的には4^4または256bpに1回、6塩基の場合は4^6または4,096bpに1回、8塩基の場合は4^8または65,536bpに1回発生します。^[28]多くは回文配列であり、つまり塩基配列は前後どちらから読んでも同じになります。^[29]理論的には、DNAには2種類の回文配列が考えられます。鏡像回文は、 GTAATGのように、DNAの一本鎖上で前後に読んでも同じ配列となる通常のテキストに見られるものと似ている。逆反復回文も前後に読んでも同じ配列であるが、前後の配列は相補的なDNA鎖（二本鎖DNA）に見られ、GTATAC（GTATACはCATATGと相補的）に見られる。^[30]逆反復回文は鏡像回文よりも一般的であり、生物学的に重要である。

EcoRI消化により「粘着性」末端が生成される。

一方、SmaI制限酵素による切断では「平滑末端」が生成されます。

DNAの認識配列は制限酵素ごとに異なり、酵素制限の粘着末端「オーバーハング」の長さ、配列、鎖の向き（5'末端または3'末端）に違いが生じます。 ^[31]

同じ配列を認識する異なる制限酵素は、ネオシゾマーと呼ばれます。これらは、多くの場合、配列の異なる場所で切断します。同じ場所を認識して切断する異なる酵素は、アイソシゾマーと呼ばれます。

天然に存在する制限酵素は、その組成と酵素補因子要件、標的配列の性質、標的配列に対する DNA 切断部位の位置に基づいて、5 つのグループ (タイプ I、II、III、IV、および V) に分類されます。^{[32] [33] [34]} ただし、制限酵素の DNA 配列分析では大きなばらつきが見られ、4 つ以上のタイプがあることが示されています。^[35]すべてのタイプの酵素は、特定の短い DNA 配列を認識し、DNA のエンドヌクレアーゼ切断を実行して、末端 5'-リン酸を持つ特定の断片を生成します。認識配列、サブユニット組成、切断位置、補因子要件が異なり、^{[36] [37]}以下にまとめます。

• タイプ I 酵素 ( EC 3.1.21.3) は認識部位から離れた部位で切断します。機能するにはATPとS-アデノシル-L-メチオニンの両方が必要です。制限消化とメチラーゼ ( EC 2.1.1.72) 活性の両方を備えた多機能タンパク質です。
• タイプ II 酵素 ( EC 3.1.21.4) は、認識部位内または認識部位から短い特定の距離で切断します。ほとんどがマグネシウムを必要とします。メチラーゼに依存しない単一機能 (制限消化) 酵素です。
• タイプ III 酵素 ( EC 3.1.21.5) は、認識部位から近い場所で切断します。ATP が必要ですが、加水分解はしません。S-アデノシル-L-メチオニンは反応を刺激しますが、必須ではありません。修飾メチラーゼ ( EC 2.1.1.72) との複合体の一部として存在します。
• IV型酵素は、メチル化、ヒドロキシメチル化、グルコシルヒドロキシメチル化DNAなどの修飾DNAを標的とする。
• V型酵素はガイドRNA（gRNA）を利用する

タイプ I 制限酵素は最初に同定された酵素であり、大腸菌の 2 つの異なる株 (K-12 および B) で最初に同定されました。^[38]これらの酵素は、認識部位とは異なる、認識部位からランダムな距離 (少なくとも 1000 bp) 離れた部位で切断します。これらのランダムな部位での切断は DNA 転座のプロセスに続くため、これらの酵素が分子モーターでもあることがわかります。認識部位は非対称で、約 6～8 ヌクレオチドの非特異的スペーサーによって分離された 2 つの特定の部分(3 ～ 4 ヌクレオチドを含む部分と4 ～ ⁵ヌクレオチドを含む部分)で構成されています。これらの酵素は多機能で、標的 DNA のメチル化状態に応じて、制限消化と修飾の両方の活性を発揮します。タイプI制限酵素は、HsdR、HsdM、HsdSと呼ばれる3つのサブユニットを持っています。HsdRは制限消化に必要であり、HsdMは宿主DNAにメチル基を付加するために必要であり（メチルトランスフェラーゼ活性）、HsdSは制限消化（DNA切断）と修飾（DNAメチルトランスフェラーゼ）活性の両方に加えて、認識（DNA結合）部位の特異性に重要です。^{[32] [38]}

タイプII部位特異的デオキシリボヌクレアーゼ様
二本鎖DNA（茶色のチューブ）に結合したホモ二量体制限酵素EcoRI（水色と緑色の漫画図）の構造。 [39] 2つの触媒マグネシウムイオン（各モノマーから1つ）はマゼンタ色の球として示され、酵素によって切断されたDNAの部位（DNAバックボーンのギャップとして示される）に隣接しています。
識別子
シンボル	Restrct_endonuc-II のような
ファム一族	CL0236
インタープロ	著作権
SCOP2	1wte / スコープ / SUPFAM

典型的なタイプII制限酵素は、タイプI制限酵素とはいくつかの点で異なります。これらはホモ二量体を形成し、認識部位は通常分割されておらず、回文構造で、長さは4～8ヌクレオチドです。これらは同じ部位でDNAを認識して切断し、その活性にはATPやAdoMetを使用せず、通常は補因子としてMg ^{2+のみを必要とします。 [29]} これらの酵素は二重らせんDNAのホスホジエステル結合を切断します。両鎖の中央で切断して平滑末端にすることも、ずらした位置で切断してスティッキーエンドと呼ばれる突出部を残すこともできます。^[40]これらは最も一般的に利用され、使用されている制限酵素です。 1990年代から2000年代初頭にかけて、この酵素クラスの古典的な基準のすべてに従わないこのファミリーの新しい酵素が発見され、この大きなファミリーをII型酵素の典型的な特徴からの逸脱に基づいてサブカテゴリに分割する新しいサブファミリー命名法が開発されました。 ^[29]これらのサブグループは文字の接尾辞を使用して定義されます。

タイプIIB制限酵素（例：BcgIおよびBplI）は、複数のサブユニットを含む多量体である。 ^[29]これらは認識部位を切り出すために認識部位の両側でDNAを切断する。AdoMetとMg ²⁺補因子の両方を必要とする。タイプIIE制限エンドヌクレアーゼ（例：NaeI）は、認識配列の2つのコピーとの相互作用の後にDNAを切断する。^[29] 1つの認識部位は切断の標的として機能し、もう1つは酵素切断の効率を加速または改善するアロステリックエフェクターとして機能する。タイプIIE酵素と同様に、タイプIIF制限エンドヌクレアーゼ（例：NgoMIV）は認識配列の2つのコピーと相互作用するが、両方の配列を同時に切断する。^[29]タイプIIG制限エンドヌクレアーゼ（例：RM.Eco57I）は、古典的なタイプII制限酵素のように単一のサブユニットを有するが、活性化するには補因子AdoMetを必要とする。^[29] DpnIなどのIIM型制限酵素は、メチル化されたDNAを認識して切断することができる。^{[29] [41] [42]} IIS型制限酵素（FokIなど）は、非回文非対称認識部位から定義された距離でDNAを切断する。^{[29]この特性は、}ゴールデンゲートクローニングなどのin vitroクローニング技術を実行するために広く使用されている。 これらの酵素は二量体として機能する場合がある。同様に、IIT型制限酵素（Bpu10IやBslIなど）は2つの異なるサブユニットで構成される。一部は回文配列を認識し、他のものは非対称認識部位を有する。^[29]

タイプ III 制限酵素 (例: EcoP15) は、逆向きの 2 つの別々の非回文配列を認識します。これらは認識部位から 20～30 塩基対ほど後ろで DNA を切断します。^[43]これらの酵素は複数のサブユニットを含み、それぞれ DNA メチル化と制限消化の役割を担うために AdoMet と ATP 補因子を必要とします。^[44]これらは、外来 DNA の侵入から生物を保護する原核生物のDNA 制限修飾機構の構成要素です。タイプ III 酵素は、Res ( P08764 ) と Mod ( P08763 )の 2 つのサブユニットからなるヘテロオリゴマーの多機能タンパク質です。Mod サブユニットは、システムに特有の DNA 配列を認識する修飾メチルトランスフェラーゼです。そのため、機能的にはタイプ I 制限エンドヌクレアーゼの M サブユニットと S サブユニットと同等です。Res は制限消化に必要ですが、それ自体には酵素活性はありません。タイプ III 酵素は、5～6 bp の短い非対称 DNA 配列を認識し、下流の25～27 bp を切断して、短い一本鎖の 5' 突起を残します。制限酵素分解が起こるためには、2 つの逆向きのメチル化されていない認識部位が必要です。これらの酵素は、DNA の 1 本の鎖、アデニン残基の N-6 位のみをメチル化するため、新しく複製された DNA は 1 本の鎖のみがメチル化され、制限酵素分解から保護するのに十分です。タイプ III 酵素は、N6 アデニンメチルトランスフェラーゼのベータサブファミリーに属し、このファミリーを特徴付ける9 つのモチーフを含み、モチーフI、AdoMet結合ポケット (FXGXG)、モチーフ IV、触媒領域 (S/D/N (PP) Y/F) が含まれます。^{[36] [45]}

IV型酵素は修飾された、典型的にはメチル化されたDNAを認識し、大腸菌のMcrBCおよびMrrシステムがその例である 。^[35]

タイプV制限酵素（例えば、CRISPRのcas9 -gRNA複合体^[46]）は、ガイドRNAを利用して、侵入生物に見られる特定の非回文配列を標的とする。適切なガイドRNAが提供されれば、さまざまな長さのDNAを切断することができる。これらの酵素は柔軟性が高く、使いやすいため、将来の遺伝子工学への応用が期待されている。^{[46] [47]}

人工制限酵素は、天然または人工のDNA結合ドメインをヌクレアーゼドメイン（多くの場合、IIS型制限酵素FokIの切断ドメイン）に融合することによって生成できます。^[48]このような人工制限酵素は、大きなDNA部位（最大36 bp）をターゲットにすることができ、目的のDNA配列に結合するように設計できます。^[49] ジンクフィンガーヌクレアーゼは最も一般的に使用される人工制限酵素であり、一般的に遺伝子工学アプリケーションで使用されますが、^{[50] [51] [52] [53]より標準的な}遺伝子クローニングアプリケーションにも使用できます。 ^{[54]その他の人工制限酵素は、} TALエフェクターのDNA結合ドメインに基づいています。^{[55] [56]}

2013年には、原核生物のウイルス防御システムに基づいた新しい技術CRISPR-Cas9がゲノム編集用に開発され、すぐに研究室に導入されました。^[57]詳細については、「CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）」を参照してください。

2017年、イリノイ大学の研究グループは、ピロコッカス・フリオサス（PfAgo）から採取したアルゴノートタンパク質とガイドDNAを人工制限酵素として用いて、試験管内でDNAを編集したと報告した。 ^[58]

RNAの制限酵素として機能する人工リボヌクレアーゼも開発されている。PNAzymeと呼ばれるPNAベースのシステムは、特定のRNA配列に対するリボヌクレアーゼを模倣し、酵素がRNAに結合したときに形成される標的RNAの非塩基対領域（RNAバルジ）を切断するCu(II) -2,9-ジメチルフェナントロリン基を有する。この酵素は、ミスマッチがない、または2つの切断可能な部位のうち速度論的に好ましい1つの部位のみを切断することで選択性を示す。^[59]

1970年代に発見されて以来、多くの制限酵素が同定されてきました。例えば、3500種類以上のII型制限酵素が特徴付けられています。^[60]各酵素は、細菌の属、種、株に基づいた命名システムを使用して、分離された細菌にちなんで命名されています。^{[61] [62]}例えば、EcoRI制限酵素の名前は、ボックスに示すように由来しました。

分離された制限酵素は、さまざまな科学的用途のために DNA を操作するために使用されます。

これらは、遺伝子クローニングやタンパク質生産実験中に、遺伝子をプラスミドベクターに挿入するのを助けるために使用されます。最適に使用するために、遺伝子クローニングに一般的に使用されるプラスミドは、制限認識配列が豊富な短いポリリンカー配列（マルチクローニングサイト、またはMCSと呼ばれる）を含むように変更されています。これにより、遺伝子断片をプラスミドベクターに挿入する際の柔軟性が得られます。遺伝子内に自然に含まれる制限部位は、DNAの末端を意図的に切断しながら目的のDNAの制限を回避する必要があるため、DNAを消化するためのエンドヌクレアーゼの選択に影響します。遺伝子断片をベクターにクローニングするには、通常、プラスミドDNAと遺伝子インサートの両方を同じ制限酵素で切断し、DNAリガーゼと呼ばれる酵素の助けを借りて接着します。^{[63] [64]}

制限酵素は、一塩基多型（SNP）として知られるDNAの単一塩基の変化を特異的に認識することにより、遺伝子対立遺伝子を区別するためにも使用できる。 ^{[65] [66]}ただし、これはSNPが対立遺伝子に存在する制限部位を変更する場合にのみ可能である。 この方法では、制限酵素を使用して、高価な遺伝子配列決定を必要とせずにDNAサンプルの遺伝子型を判定することができる。 サンプルは最初に制限酵素で消化されてDNA断片が生成され、次に異なるサイズの断片がゲル電気泳動によって分離される。 一般に、正しい制限部位を持つ対立遺伝子はゲル上で2つの目に見えるDNAバンドを生成し、変更された制限部位を持つ対立遺伝子は切断されずに1つのバンドのみを生成する。制限消化によるDNAマップも生成され、遺伝子の相対的な位置を示すことができる。^{[67]制限消化によって生成された異なる長さのDNAは、ゲル電気泳動後に特定のバンドパターンも生成し、} DNAフィンガープリンティング に使用できる。

同様に、制限酵素はサザンブロットによる遺伝子分析のためにゲノムDNAを消化するために使用される。この技術により、研究者は1人の個体のゲノムに遺伝子のコピー（またはパラログ）がいくつ存在するか、または集団内で遺伝子変異（多型）がいくつ発生したかを特定することができる。後者の例は制限断片長多型（RFLP）と呼ばれる。^[68]

FokI DNA 切断ドメインを DNA 結合タンパク質またはジンクフィンガーアレイのアレイと結合させて作成された人工制限酵素は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) と呼ばれ、配列特異性が強化されているため、宿主ゲノム編集の強力なツールです。ZFN はペアで機能し、その二量体化は FokI ドメインを介してその場で媒介されます。各ジンクフィンガーアレイ (ZFA) は 9～12 塩基対を認識でき、ペアで 18～24 になります。切断部位間の 5～7 bp のスペーサーにより、ZFN の特異性がさらに強化され、ヒトに適用できる安全でより正確なツールになります。最近、HIV-1 の CCR5 共受容体を標的とした ZFN の第 1 相臨床試験が実施されました。^[69]

細菌のRMシステムはバクテリオファージの向性を制限することで細菌の生来の防御の役割を果たしているため、細菌のRMシステムをモデルとしてヒトの抗ウイルス遺伝子またはゲノムワクチンや治療法を考案することを提案する人もいます。^[70] HSV-2、高リスクHPV、HIV-1など、さまざまなヒトウイルスのDNAを切断できるREaseとZFNに関する研究があり、最終目的はヒト感染ウイルスの標的変異と異常を誘発することです。^{[71] [72] [73]}ヒトゲノムにはすでに、不活性化されて自己利益のために利用されたレトロウイルスゲノムの残骸が含まれています。実際、3つの主要な修復エキソヌクレアーゼ1（TREX1）と切除修復クロス補完1（ERCC）による活性L1ゲノムレトロエレメントのサイレンシングのメカニズムは、細菌のRMシステムの作用と、修復テンプレートなしでZFNを使用した後に起こる非相同末端結合（NHEJ）を模倣しているようです。^{[74] [75]}

制限酵素の例としては以下が挙げられる: ^[76]

キー:
* = 鈍端
N = C または G または T または A
W = A または T

• BglII – 制限酵素
• EcoRI – 制限酵素
• HindIII – 制限酵素
• ホーミングエンドヌクレアーゼ
• ホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位のリスト
• 制限酵素切断部位のリスト
• 分子量サイズマーカー
• REBASE (データベース)
• スターの活動

• 米国国立医学図書館の医学件名標目(MeSH)にある DNA 制限酵素
• Firman K (2007-11-24). 「タイプ I 制限修飾」. ポーツマス大学. 2008-07-06 にオリジナルからアーカイブ。2008-06-06に取得。
• Goodsell DS (2000-08-01). 「制限酵素」。今月の分子。RCSB タンパク質データバンク。2008-05-31 にオリジナルからアーカイブ。2008-06-06に取得。
• Simmer M、Secko D (2003-08-01)。「制限エンドヌクレアーゼ: DNA を特異的に切断する分子ハサミ」。The Science Creative Quarterly。2008-06-06に取得。
• Roberts RJ、Vincze T、Posfai、J、Macelis D. 「REBASE」。2015 年 2 月 16 日にオリジナルからアーカイブ。2008 年 6 月 6 日に取得。制限酵素データベース。