制限変更システム

制限修飾システム( RMシステム) は細菌や古細菌に見られ、バクテリオファージが持つような外来DNAに対する防御を提供します。

細菌には制限酵素（制限エンドヌクレアーゼとも呼ばれる）があり、特定の位置で二本鎖 DNA を断片に切断し、その後、他のエンドヌクレアーゼによってさらに分解されます。これにより、感染性因子（バクテリオファージなど）によって持ち込まれた外来DNA が効果的に破壊され、感染が防止されます。既知の細菌の約 4 分の 1 が RM システムを持ち、そのうちの約半分が 2 種類以上のシステムを持っています。

制限酵素によって認識される配列は非常に短いため、細菌自体のゲノム内にもその配列が含まれている可能性が高くなります。制限酵素による自身の DNA の破壊を防ぐために、メチル基が追加されます。これらの変更は DNA の塩基対形成を妨げてはならないため、通常は各鎖で特定の塩基数個のみが変更対象となります。

エンドヌクレアーゼは、内部/非末端ホスホジエステル結合を切断します。エンドヌクレアーゼは、通常 4～6 塩基対の長さで、回文構造であることが多い DNA 内の特定の配列を認識した後でのみ、切断を行います。

RMシステムは、 1952年と1953年にサルバトーレ・ルリアとメアリー・ヒューマンによって初めて発見されました。 ^{[1] [2]}彼らは、感染した細菌内で増殖するバクテリオファージを改変することができ、その結果、放出されて関連細菌に再感染すると、バクテリオファージの増殖が制限（阻害）されることを発見しました。これは、1984年にルリアが自伝の45ページと99ページにも記述されています。 ^[3] 1953年に、ジャン・ヴァイグルとジュゼッペ・ベルターニは、異なるバクテリオファージシステムを使用した、同様の宿主制御改変の例を報告しました。^[4]その後、1962年のデイジー・ルーラン・デュソワとヴェルナー・アーバーによる研究^[5]や、その後の多くの研究者によって、制限は、改変されたバクテリオファージのDNAが受容体細菌の特定の酵素によって攻撃され、分解されるためであると理解されるようになりました。ハミルトン・O・スミスによるさらなる研究により、現在制限酵素として知られている酵素のクラスの最初のHinDIIが単離され、ダニエル・ネイサンズはそれが制限マッピングに使用できることを示しました。^{[6]これらの酵素が研究室で単離されると、DNAの制御された操作に使用できるようになり、}遺伝子工学 の発展の基礎が築かれました。ヴェルナー・アーバー、ダニエル・ネイサンズ、ハミルトン・スミスは、制限修飾に関する研究により、1978年にノーベル生理学・医学賞を受賞しました。^[要出典]

制限修飾システムには、タイプI、タイプII、タイプIII、タイプIVの4つのカテゴリがあります。 [ ^7]すべて制限酵素活性とメチラーゼ活性を持っています（メチラーゼ活性を持たないタイプIVを除く）。これらは発見順に命名されていますが、タイプIIシステムが最も一般的です。^[7]

タイプ I システムは最も複雑で、R (制限)、M (修飾)、S (特異性) の 3 つのポリペプチドで構成されています。結果として得られる複合体は、DNA を切断およびメチル化できます。どちらの反応にも ATP が必要で、切断は認識部位からかなり離れた場所で発生することがよくあります。S サブユニットは、制限とメチル化の両方の特異性を決定します。切断は認識配列からさまざまな距離で発生するため、ゲル電気泳動では個別のバンドを簡単に視覚化することはできません。^{[引用が必要]}

タイプ II システムは最も単純で最も普及している。^[8]メチルトランスフェラーゼとエンドヌクレアーゼは複合体として機能するのではなく、2 つの別々のタンパク質としてコード化され、独立して機能する (特異性タンパク質はない)。両方のタンパク質は同じ認識部位を認識するため、活性を競う。メチルトランスフェラーゼはモノマーとして機能し、一度に 1 つの鎖を二重鎖のメチル化する。エンドヌクレアーゼはホモ二量体として機能し、両方の鎖の切断を促進する。切断は認識配列の近くまたは認識配列内の特定の位置で発生するため、ゲル電気泳動中に個別の断片が生成される。このため、タイプ II システムはDNA 分析や遺伝子クローニングの研究室で使用されている。^[要出典]

タイプ III システムには、修飾と切断の複合体を形成する R (res) と M (mod) タンパク質があります。ただし、M タンパク質は単独でメチル化できます。また、メチル化は、他のほとんどの既知のメカニズムとは異なり、DNA の 1 つの鎖でのみ発生します。Rタンパク質と M タンパク質によって形成されるヘテロ二量体は、同じ反応を修飾および制限することで、それ自体と競合します。これにより、不完全な消化が発生します。^{[9] [10]}

タイプIVシステムは制限酵素のみを含み、メチラーゼを含まないため、真のRMシステムではありません。他のタイプとは異なり、タイプIV制限酵素は修飾されたDNAのみを認識して切断します。^[11]

髄膜炎菌は、自然遺伝子形質転換に用いられる複数のタイプ II 制限エンドヌクレアーゼ システムを持っています。自然遺伝子形質転換とは、受容細菌細胞が近隣の供与細菌細胞から DNA を取り込み、組み換えによってこの DNA をゲノムに組み込むプロセスです。制限修飾システムに関する初期の研究は、侵入するバクテリオファージ DNA やその他の外来 DNA から細菌が自らを守るという利点に焦点を当てていましたが、現在では、これらのシステムは、自然形質転換によって同じ種または関連種の他のメンバーから導入された DNA を制限するためにも使用できることがわかっています。^{[引用が必要]}

病原性細菌である髄膜炎菌（ Neisseria meningitidis）では、形質転換能力は高度に進化した複雑なプロセスであり、細菌表面、膜、細胞質にある複数のタンパク質が、入ってくる形質転換DNAと相互作用します。制限修飾システムはNeisseria属に豊富です。 髄膜炎菌は、複数のII型制限エンドヌクレアーゼシステムを持っています。^[12]髄膜炎菌 の制限修飾システムは、異なる系統群間で特異性が異なります。^{[12] [13]} この特異性は、系統群間のDNA交換に対する効果的な障壁を提供します。^[12] Luriaは、自伝の99ページで、^[3]こうした制限行動を「極度の非友好的な例」と呼んでいます。制限修飾は、髄膜炎菌における性的隔離と種分化の主な要因であると思われます。^[14] CaugantとMaiden ^[15]は、髄膜炎菌の制限修飾システムは、非常に近縁種間での遺伝子交換を可能にする一方で、異なるクローン複合体や関連種に属する髄膜炎菌間の遺伝子交換を減らす（完全に防止するわけではない）働きをする可能性があると示唆した。^[要出典]

RMシステムは利己的な遺伝要素としても機能し、分離後の細胞死を通じて細胞に維持を強制する。^[16]

一部のウイルスは、制限酵素を阻害するメチル基またはグリコシル基を追加することで自身の DNA を改変し、制限酵素の働きを阻害するなど、制限修飾システムを破壊する方法を発達させています。バクテリオファージ T3 や T7 などの他のウイルスは、制限酵素を阻害するタンパク質をコードしています。^{[引用が必要]}

これらのウイルスに対抗するため、一部の細菌は、改変された DNA のみを認識して切断し、宿主の改変されていない DNA には作用しない制限システムを発達させてきました。一部の原核生物は、複数の種類の制限改変システムを開発しました。^{[引用が必要]}

RMシステムは雑種に多く存在し、同族RMシステムを持つ系統内および系統間で遺伝子交換の優先経路を確立します。^[17]細菌系統におけるRMシステムのレパートリーおよび/または特異性は急速に変化するため、種内での遺伝子伝達の優先的な流れは常に変化し、時間依存の遺伝子伝達ネットワークが形成されると予想されます。^[要出典]

(a) クローニング: RM システムはプラスミドにクローニングされ、メチル化酵素によって耐性が得られるため選択されます。プラスミドが複製を開始すると、メチル化酵素が生成され、プラスミド DNA をメチル化して、特定の制限酵素から保護します。^{[引用が必要]}

(b) 制限酵素断片長多型: 制限酵素は、REase 切断特異性に影響を与える変異の有無に関して DNA の構成を分析するためにも使用されます。野生型と変異体を異なる REase で消化して分析すると、ゲル電気泳動産物の長さが異なります。これは主に、変異体遺伝子が野生型と同様のパターンで切断されず、REase が変異体配列に非特異的になるような変異が存在するためです。^{[引用が必要]}

細菌のRMシステムは、バクテリオファージの向性を制限することで細菌の生来の防御役割を果たすため、ヒトの抗ウイルス遺伝子またはゲノムワクチンおよび治療法を考案するためのモデルとして提案されてきました。^[18] HSV-2、高リスクHPV、HIV-1など、さまざまなヒトウイルスのDNAを切断できるREaseとZFNに関する研究が行われており、最終目標は、ヒトに感染するウイルスの標的変異と異常を誘発することです。^{[19] [20] [21]}ヒトゲノムにはすでに、不活性化されて自己利益のために利用されたレトロウイルスゲノムの残骸が含まれています。実際、3つの主要な修復エキソヌクレアーゼ1（TREX1）と切除修復クロス補完1（ERCC）による活性L1ゲノムレトロエレメントのサイレンシングのメカニズムは、細菌のRMシステムの作用と、修復テンプレートなしでZFNを使用した後に起こる非相同末端結合（NHEJ）を模倣しているようです。^{[22] [23]}

大きな進歩は、FokI DNA 切断ドメインを DNA 結合タンパク質のアレイまたはジンクフィンガーアレイと結合させることによって作成された人工制限酵素の作成であり、現在ではジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) と呼ばれています。^[24] ZFN は、配列特異性が向上しているため、宿主ゲノム編集の強力なツールです。ZFN はペアで機能し、その二量体化は FoKI ドメインを介して in situ で媒介されます。各ジンクフィンガーアレイ (ZFA) は 9～12 塩基対を認識でき、ペアで 18～24 になります。切断部位間の 5～7 bp のスペーサーにより、ZFN の特異性がさらに強化され、ヒトに適用できる安全でより正確なツールになります。最近、HIV-1 の CCR5 共受容体を標的とした ZFN の第 I 相臨床試験が実施されました。^[25]

RMシステムは、可動性遺伝要素（MGE）とその宿主との共進化的相互作用において主要な役割を果たしている。 ^[26] RMシステムをコードする遺伝子は、プラスミド、プロファージ、挿入配列/トランスポゾン、接合要素（ICE）、インテグロンなどのMGE内で原核生物のゲノム間を移動することが報告されている。しかし、最近、プラスミドには比較的少ないRMシステムがあり、プロファージにはいくらかあるが、ファージにはほとんどないことがわかった。一方、これらすべてのMGEは、MTaseに代表される多数の孤立したRM遺伝子をコードしている。^[26]このことを考慮すると、RMの移動性はMGEにあまり依存せず、たとえば小さなゲノム統合ホットスポットの存在に大きく依存している可能性がある。 RM システムは、ゲノム間を移動するために、自然変換、小胞、ナノチューブ、遺伝子導入剤、一般化された形質導入などの他のメカニズムを頻繁に利用する可能性もあります。^{[引用が必要]}

• メチル化
• 制限酵素