ミケ

定量的リアルタイムPCR実験の公表のための最小限の情報（MIQE ）ガイドラインは、定量的リアルタイムPCR実験とデータを実施および報告するための一連のプロトコルであり、2009年にBustinらによって考案されました。^[1]これらは、RT-qPCRを使用して自閉症児の麻疹ウイルスを検出したと主張する論文が2002年に発表された後に考案されましたが、その結果は他の科学者によって完全に再現不可能であることが判明しました。 ^[2]著者自身もそれを再現しようとせず、生データには大量のエラーと分析の基本的な間違いがあることがわかりました。この事件をきっかけに、Stephen Bustinは科学文献で公表されるqPCRデータのベースライン品質レベルを提供するためにMIQEガイドラインを作成しました。^[2]

MIQE ガイドラインは、当時学術誌に提出された qPCR データの品質が低いために作成されました。次世代シーケンシング機器により、このような実験をより安価に実行できるようになり、qPCR はより一般的になりつつありました。この技術は科学のさまざまな分野で利用されているため、qPCR の使用方法の機器、方法、設計は大きく異なります。全体的な品質を向上させるために、MIQE ガイドラインは、他の研究者が出版された資料を読む際に理解して使用できる最低限の報告情報として収集する必要がある基本的な実験手順とデータ形式に関する一般的な提案として作成されました。このような認識され、広く合意されたガイドラインのセットを設定することは、特にさまざまな言語とプロトコルを持つ開発途上国からの科学研究の量がますます増加していることから、科学界によって重要であると考えられました。^[3]

2009年、スティーブン・バスティンはミカエル・クビスタを含む国際的な科学者グループを率いて、qPCRの実行方法と、その過程でどのような形式のデータを収集して公開すべきかに関するガイドラインをまとめました。^[1]これにより、科学雑誌の編集者や査読者は、qPCRデータを含む投稿論文を確認する際にガイドラインを使用できるようになりました。したがって、ガイドラインは手順の各ステップの一種のチェックリストとして設定され、特定の項目は出版用にデータを提出する際に必須 (E) としてマークされ、他の項目は望ましい (D) としてマークされました。^[4]

2010年9月には、蛍光ベースの定量的リアルタイムPCRで使用するためのガイドラインの追加バージョンが発行されました。これは、ガイドラインのより広範な形式の概要としても機能しました。 ^{[5]他の研究者は、}単一細胞qPCR ^[6]やデジタルPCR （dPCR）など、追加または異なるチェック項目セットを必要とする可能性のある特定の形式のqPCR用に、さらなるバージョンを作成しています。^{[7]既存のMIQEガイドラインの適切な遵守は、}光バイオモジュレーション^[8]や臨床バイオマーカーなど、他の科学分野でも概説されています。^[9]

2014年にバスティンは（そして2017年に再び）科学界ではMIQEガイドラインがある程度受け入れられ、使用されているが、最も基本的なデータ提示やそのデータの有効性の適切な確認さえ欠いたqPCR実験の論文があまりにも多く出版されていると指摘した。これらの研究は再現性に関する重大な問題を抱えており、その証拠の結論は他の研究者によって再現できず、当初の結果に疑問を投げかけていた。これはすべて、多くの論文がバスティンのオリジナルのMIQE出版物を直接引用しながらも、独自の実験で材料のガイドラインチェックリストに従っていないにもかかわらず起こった。^{[2] [10]}しかし、一部の研究者は少なくともある程度の成功を指摘しており、MIQEチェックリストに合格しなかったために学術雑誌から出版を拒否された論文がいくつかある。他の研究は、MIQEガイドラインに合格するための適切なデータが不足していることが指摘され、雑誌編集者に公に指摘された後、事後に撤回された。^[11]

ニューイングランドバイオラボは、2017年に「Dots in Boxes」と題した新しい比較qPCRシステムを構築した際、データがプロトコルの最小パラメータチェックリストすべてに適合するように、MIQEガイドラインに沿ってデータ収集部分を設計したと述べた。^[12]他の科学機器会社は、意図的にデバイスをカスタマイズすることでガイドラインの遵守を支援しており、バイオラッドは、各ステップの完了時にMIQEチェックリストをアクティブにマークできるモバイルアプリを作成した。 ^[13]

2020年6月にはMIQEガイドラインの発行10周年を振り返る調査が行われ、ガイドラインに従った場合に優れた、より体系的な結果が得られた科学的研究について議論された。^[14] 2020年8月には、2013年の最初のリリース以降の機械、技術、手法の改善を考慮して、デジタルPCR法のガイドラインの更新版が公開された。データ分析のためのガイドラインの手順が追加され、研究者が使用できるように、より簡素化されたチェックリスト表も提供された。 [ ^{15] COVID-19パンデミック中に}COVID-19ウイルス粒子の臨床的存在を特定するために、2020年12月にスティーブン・バスティンと共同で臨床バイオマーカーのMIQEガイドラインを使用してRT-qPCRターゲティングアッセイが開発された。^[16]

MIQEガイドラインは、チェックリストを構成する9つのセクションに分かれています。これらには、qPCR自体の実施に関する考慮事項だけでなく、結果データの収集、分析、および提示方法も含まれています。後者の重要な部分は、使用した分析ソフトウェアに関する情報を含めることと、生データを関連データベースに送信することです。^[1]

ガイドラインの大部分には、実験グループとコントロールグループの違いを説明する項目など、実験や出版物に必ず含まれる基本的なアクションが含まれています。その他の情報には、実験の各グループで使用されている個別のユニットの数が含まれます。これら 2 つの項目は、あらゆる研究に不可欠であると定義されています。このセクションには、著者の研究室自体が qPCR アッセイを実施したのか、大学または組織のコア研究室が実施したのかを指摘することと、研究に貢献した他の個人への謝辞という 2 つの望ましい点も含まれています。^[1]

サンプルとサンプル材料が満たさなければならない必須要件には、サンプルの説明、使用された解剖形式、行われた処理方法、サンプルが凍結または固定されたかどうか、それにかかった時間、使用されたサンプル条件が含まれます。qPCRのために処理されたサンプルの容量または質量を知ることも望ましいです。^[1]

DNA/RNAの抽出プロセスについては、いくつかの重要なガイドラインがあります。これには、行われた抽出プロセスの説明、使用されたDNA抽出キットと指示に加えられた変更に関する記述、DNaseまたはRNase処理が使用されたかどうかの詳細、汚染が評価されたかどうかに関する記述、抽出された遺伝物質の量の定量、抽出に使用された器具の説明、RNAの完全性を維持するために使用された方法、RNAの完全性番号と品質指標および到達した定量サイクル（Cq）に関する記述、そして最後に、阻害物質の有無を判断するために行われたテストが含まれます。必要な情報は、使用した試薬の入手先、得られた遺伝的純度のレベル、得られた収量、および確認のための電気泳動ゲル画像です。^[1]

この段階の主な必須事項には、反応条件の詳細、使用したRNAの量と反応の総量、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドとその濃度、使用した逆転写酵素の濃度と種類、そして最後に反応の温度と時間などが含まれます。また、使用した試薬のカタログ番号と製造元、転写酵素の有無によるCqの標準偏差、 cDNAの保存方法も記載することが望ましいです。^[1]

ここでは、遺伝子記号、問題の配列のアクセッションデータベース番号、増幅される配列の長さ、BLASTなどの使用される特異性スクリーニングに関する情報、配列に存在するスプライシングバリアント、各プライマーのエクソンまたはイントロンの位置など、ターゲットに関するすべての基本情報が必要です。このセクションには、アンプリコンの位置、疑似遺伝子またはホモログの存在の有無、配列アライメントが行われたかどうかとそこから得られたデータ、増幅された配列の二次構造に関するデータなど、望ましいが必須ではない情報がいくつかあります。 ^[1]

オリゴヌクレオチドの作成には、使用したプライマー配列と、配列に加えられた変更の場所と詳細という2つの重要な情報のみが必要です。しかし、RTPrimerDBデータベースの識別番号、プローブの配列、オリゴの作成に使用したメーカー、オリゴの精製方法など、いくつかの望ましいデータがあります。^[1]

ガイドラインの主要なセグメントの 1 つとして、qPCR プロセス自体のチェックリストにはいくつかの重要な部分があります。これには、反応に使用されたすべての条件、反応と cDNA の両方の量、プローブ、マグネシウムイオン、dNTPの濃度、使用されたポリメラーゼの種類とその濃度、使用されたキットとその製造元、反応に使用された添加剤、qPCR マシンの製造元、およびサーモサイクリングプロセスに設定されたパラメーターが含まれます。必要な追加情報は、使用したバッファーの化学組成、使用したプレートとチューブの製造元とそのカタログ番号、および反応が手動で設定されたか、機械で設定されたかだけです。^{[1] [17]}

実行されたqPCRプロセスの有効性と品質を確認するには、いくつかのアクションとそれに続くデータを提示する必要があります。これには、ゲルの使用、遺伝物質の直接配列決定、融解プロファイルの表示、または制限酵素による消化など、プロセスが機能したことを確認する具体的な方法の説明が含まれます。SYBR Green Iを使用した場合は、テンプレートDNAを含まないコントロールグループのCqを示す必要があります。さらに重要なデータには、傾きとy切片を記録した機械曲線の較正、前述の傾きから決定されたPCRプロセスの効率、較正曲線の相関係数（r二乗）、線形曲線のダイナミックレンジ、結果の95％が依然として陽性であった最低濃度で検出されたCq（LOD）とLOD自体の証拠、そして最後に、マルチプレックスが使用されている場合は、実行された各アッセイの効率とLODを示す必要があります。^{[1] [17]}

追加の望ましい情報には、勾配の使用によってqPCRの最適化が行われたことを示す証拠、 qPCRの効率を示す信頼区間、およびテストされた範囲全体の信頼区間が含まれます。^[1]

ガイドラインの最後のセクションには、qPCR データの分析方法に関する情報が含まれています。その重要な部分には、分析に使用されたプログラムとプログラムのバージョン、Cq の決定方法、データ内の外れ値ポイントの特定とそれらの使用または除外方法と理由、テンプレート遺伝物質のないコントロールで見つかった結果、使用された参照遺伝子の選択理由とその数の理由の説明、データの正規化に使用された方法、含まれた技術的複製の数、アッセイ内のデータの再現性、結果の重要性を決定するために使用された方法、および定性分析のこの部分に使用されたソフトウェアが含まれます。^[1]

また、生物学的複製の数とそれが技術的複製の結果と一致したかどうか、濃度変異体の再現性データ、検出力分析のデータに関する情報を含めることが望ましく、最後に研究者は生データをRDMLファイル形式で提出する必要がある。^{[1] [18]}

• Shipley, Greg (2011)。「MIQE ガイドラインの秘密」。Kennedy, Suzanne、Oswald, Nick (編)。PCR トラブルシューティングと最適化: 必須ガイド。Horizo ​​n Scientific Press。pp . 151–166。ISBN 978-1904455721。