ミクエ

2009年、スティーブン・バスティンは、ミカエル・クビスタ教授やマイケル・プファフル教授を含む国際的な科学者グループを率いて、qPCRの実施方法と、その過程で収集および公開すべきデータの形式に関する一連のガイドラインを作成しました。^{[ 1 ]}これにより、科学雑誌の編集者や査読者は、qPCRデータを含む投稿論文を審査する際に、このガイドラインを利用できるようになりました。このように、ガイドラインは手順の各ステップのチェックリストのような形式で設定され、特定の項目は、データを公開するために提出する際に必須（E）としてマークされ、他の項目は望ましい（D）としてマークされました。^{[ 4 ]}

蛍光ベースの定量的リアルタイムPCRで使用するためのガイドラインの追加バージョンが2010年9月に公開されました。これは、より広範なガイドラインの要約としても機能しました。[ ^{5 ]他}の研究者は、シングルセルqPCR ^{[ 6 ]}やデジタルPCR （dPCR） ^{[ 7 ]}など、補足または異なるチェック項目セットが必要になる可能性のある特定のqPCR形式向けに、さらにバージョンを作成しています。既存のMIQEガイドラインへの適切な準拠は、光バイオモジュレーション^{[ 8 ]}や臨床バイオマーカー^{[ 9 ]}など、他の科学分野でも概観されています。

2014年にBustinは（そして2017年にも再び）科学界ではMIQEガイドラインがある程度採用され使用されていると指摘したが、qPCR実験に関する発表論文の中には、最も基本的なデータ提示や当該データの有効性の適切な確認さえ欠如しているものが依然として非常に多く存在する。これらの研究は再現性に大きな問題を抱えており、証拠の結論は他の研究者によって再現できず、最初の結果に疑念が生じる。これは、多くの論文がBustinのMIQEの最初の発表を直接引用しているにもかかわらず、自身の実験でガイドラインのチェックリストに従っていないにもかかわらず起こったことである。^{[ 2 ] [ 10 ]}しかし、一部の研究者は、MIQEチェックリストに合格しなかったために学術誌に掲載を拒否された論文が多数あるなど、少なくともある程度の成功を指摘している。また、MIQEガイドラインに合格するための適切なデータが欠如していることが指摘され、ジャーナル編集者に公に指摘された後、研究が撤回されたケースもある。^{[ 11 ]}

2017年に「Dots in Boxes」という新しい比較qPCRシステムを立ち上げた際、New England Biolabsは、データ収集部分をMIQEガイドラインに合わせて設計し、データがプロトコルのすべての最小パラメータチェックリストに適合するようにしたと述べています。^{[ 12 ]}他の科学機器メーカーも、Bio -Radが各ステップの完了時にMIQEチェックリストをアクティブにマークできるモバイルアプリを作成するなど、ガイドラインに準拠するようにデバイスを意図的に調整することで、ガイドラインへの準拠を支援しています。^{[ 13 ]}

MIQEガイドラインの発表から10周年を迎えたことを記念する概要が2020年6月に発表され、ガイドラインに従ってより良い、より体系的な結果を出した科学的研究について議論されました。^{[ 14 ]} 2020年8月には、2013年の初版以降の機器、技術、手法の改善を反映するため、デジタルPCR法のガイドラインの更新版が発表されました。データ解析のためのガイドライン手順が追加され、研究者が使用できるより簡略化されたチェックリスト表も提供されました。^{[ 15 ]} 2020年12月には、COVID-19パンデミック中にCOVID-19ウイルス粒子の臨床的存在を特定するために、臨床バイオマーカーに関するMIQEガイドラインを使用して、Stephen Bustinと共同でRT-qPCRターゲティングアッセイが開発されました。^{[ 16 ]}

ガイドラインの大部分には、実験群と対照群の差異を記述する項目など、通常であれば実験や論文に含めるべき基本的な手順が含まれています。その他の情報としては、実験で各グループで使用された個々のユニットの数などがあります。これら2つの項目は、あらゆる研究に不可欠であると定義されています。このセクションには、qPCRアッセイを著者自身の研究室または大学や組織のコアラボラトリーが実施したかどうかを示すこと、および研究に貢献した他の個人への謝辞という2つの望ましい点も含まれています。^{[ 1 ]}

サンプルおよびサンプル材料が満たすべき必須要件には、サンプルの説明、使用された解剖方法、行われた処理方法、サンプルが凍結または固定されたかどうか、その所要時間、および使用されたサンプル条件が含まれます。qPCR用に処理されたサンプルの体積または質量を知ることも望ましいです。^{[ 1 ]}

DNA/RNA抽出プロセスには、いくつかの重要なガイドラインがあります。これには、実施した抽出プロセスの説明、使用したDNA抽出キットとその手順への変更に関する記述、DNaseまたはRNase処理を使用したかどうかの詳細、汚染の有無を評価したかどうかの記述、抽出した遺伝物質の量の定量、抽出に使用した機器の説明、RNAの完全性を維持するために使用した方法、RNA完全性番号と品質指標、到達した定量サイクル（Cq）に関する記述、そして最後に、阻害物質の有無を判断するために実施したテストが含まれます。必要な4つの情報は、使用した試薬の入手先、得られた遺伝的純度のレベル、得られた収量、および確認のための電気泳動ゲル画像です。^{[ 1 ]}

この段階で最も重要な部分は、反応条件を完全に詳細に記述することであり、使用したRNAの量と反応の総容量の両方を示し、プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドとその濃度、使用した逆転写酵素の濃度と種類、そして最後に反応の温度と時間に関する情報を提供する。また、使用した試薬のカタログ番号とその製造元、逆転写酵素の有無によるCqの標準偏差、およびcDNAの保存方法も記載することが望ましい。^{[ 1 ]}

ここでは、遺伝子シンボル、問題の配列のアクセッションデータベース番号、増幅される配列の長さ、BLASTなどの特異性スクリーニングに関する情報、配列に存在するスプライシングバリアント、各プライマーのエクソンまたはイントロンの位置など、ターゲットに関するすべての基本情報が必要です。このセクションでは、アンプリコンの位置、偽遺伝子または相同遺伝子が存在するかどうか、配列アライメントが実行されたかどうか、そこから得られたデータ、増幅された配列の二次構造に関するデータなど、望ましいが必須ではない情報がいくつかあります。^{[ 1 ]}

オリゴヌクレオチドの作成には、使用するプライマー配列と、配列に加えた変更の位置と詳細という、2つの必須情報のみが必要です。しかし、RTPrimerDBデータベースの識別番号、プローブの配列、オリゴの製造に使用したメーカー、および精製方法など、望ましいデータがいくつかあります。^{[ 1 ]}

ガイドラインの主要なセグメントの 1 つとして、qPCR プロセス自体のチェックリストにはいくつかの重要な項目があります。これには、反応に使用された条件の全セット、反応と cDNA の両方の容量、プローブ、マグネシウムイオン、およびdNTPの濃度、使用されたポリメラーゼの種類とその濃度、使用されたキットとその製造元、反応に使用された添加剤、qPCR 装置の製造元、およびサーマルサイクリングプロセスに設定されたパラメーターが含まれます。追加で必要な情報は、使用されたバッファーの化学組成、使用されたプレートとチューブの製造元とそのカタログ番号、および反応が手動でセットアップされたか、機械によってセットアップされたかだけです。^{[ 1 ] [ 17 ]}

実施したqPCRプロセスの有効性と品質を確認するために、いくつかの手順とそれに続くデータを提示する必要があります。これには、ゲル電気泳動、遺伝物質の直接シーケンス、融解プロファイルの表示、制限酵素による消化など、プロセスが機能したことを確認するための具体的な方法の説明が含まれます。SYBR Green Iを使用した場合は、テンプレートDNAを含まないコントロールグループのCq値を提示する必要があります。^{[ 1 ]}

さらに重要なデータには、傾きとy切片が記録された機械曲線のキャリブレーション、前述の傾きから決定されたPCRプロセスの効率、キャリブレーション曲線の相関係数（r二乗）、線形曲線のダイナミックレンジ、結果の95%がまだ陽性であった最低濃度（LOD）で見つかったCqとLOD自体の証拠、そして最後にマルチプレックスを使用する場合は、実行された各アッセイの効率とLODが示される必要があります。^{[ 1 ] [ 17 ]} LODの決定に加えて、ISO規格に従って診断アッセイの定量限界（LOQ）も決定する必要があり、HaysらによるAAPSホワイトペーパーの推奨事項に従って医薬品開発の定量限界（LOQ）も決定する必要があります。^{[ 18 ]}これらの計算は、標準曲線の繰り返し分析に基づいています。^{[ 19 ]}

追加で必要な情報には、勾配の使用によってqPCRの最適化が行われたという証拠、qPCRの効率を示す信頼区間、およびテストされた全範囲の信頼区間が含まれます。 ^{[ 1 ]}

ガイドラインの最終セクションでは、qPCR データの分析方法に関する情報が記載されています。その重要な部分には、分析に使用したプログラムとプログラムのバージョン、Cq の決定方法、データ内の外れ値の特定方法と、それらの使用または除外方法とその理由、テンプレート遺伝物質のないコントロールで得られた結果、使用した参照遺伝子の選択理由と、その数の選択理由、データの正規化に使用した方法、含まれた技術的複製数、アッセイ内でのデータの再現性、結果の有意性を判断するために使用した方法、および定性分析のこの部分に使用したソフトウェアが含まれます。^{[ 1 ]}

また、生物学的複製数とその技術的複製の結果との一致性、濃度バリアントの再現性データ、検出力分析データ、そして最後に研究者がRDMLファイル形式で生データを提出することに関する情報も含めることが望ましい。^{[ 1 ] [ 20 ]}