プライマーダイマー

プライマーダイマー（PD ）は、一般的なバイオテクノロジー手法であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で生成される可能性のある副産物です。その名前が示すように、PDはプライマー内の相補的な塩基の列によって互いに結合（ハイブリダイズ）した2つのプライマー分子で構成されています。その結果、DNAポリメラーゼがPDを増幅し、PCR試薬の競合を引き起こし、PCR増幅の対象となるDNA配列の増幅が阻害される可能性があります。定量PCRでは、PDが正確な定量を妨げる可能性があります。

プライマーダイマーは3つのステップで形成され、増幅されます。最初のステップでは、2つのプライマーがそれぞれの3'末端でアニールします（図のステップI）。このコンストラクトが十分に安定している場合、DNAポリメラーゼはプライマーに結合し、相補的な配列に従ってプライマーを伸長します（図のステップII）。ステップIでコンストラクトの安定性に寄与する重要な要因は、 3'末端のGC含有量の高さとオーバーラップの長さです。3番目のステップは次のサイクルで発生し、ステップIIの産物の1本鎖がテンプレートとして使用され、これに新しいプライマーがアニールして、より多くのPD産物が合成されます。^[1]

PCR 産物のゲル電気泳動後、プライマー ダイマーが見える場合があります。エチジウム ブロマイド染色ゲルの PD は、通常、中程度から高強度の 30～50 塩基対 (bp) のバンドまたはスメアとして見られ、通常 50 bp を超えるターゲット シーケンスのバンドと区別できます。

定量的PCRでは、二本鎖DNA検出用の非特異的色素であるSYBR Green Iなどの挿入色素を用いた融解曲線分析によってPDを検出することができます。PDは通常短い配列で構成されているため、標的配列よりも低い温度で変性し、融解曲線の特性によって区別することができます。

PD を防ぐ 1 つの方法は、PCR システムの物理化学的最適化、つまりプライマー、塩化マグネシウム、ヌクレオチド、イオン強度、反応温度の濃度を変更することです。この方法は、PCR におけるターゲット シーケンスの増幅効率も決定する物理化学的特性によってある程度制限されます。したがって、PD 形成を減らすと、PCR 効率も低下する可能性があります。この制限を克服するために、プライマー設計、異なる PCR 酵素システムまたは試薬の使用など、PD 形成のみを減らすことを目的とした他の方法があります。^{[引用が必要]}

プライマー設計ソフトウェアは、DNA二次構造形成の可能性とプライマー同士またはプライマーペア内でのプライマーのアニーリングをチェックするアルゴリズムを使用する。ソフトウェアが考慮する物理的パラメータは、プライマーの潜在的な自己相補性とGC含有量、プライマーの融解温度の類似性、およびDNA標的配列におけるステムループなどの二次構造の欠如である。^[2]

プライマーは互いに低い相補性を持つように設計されているため、反応混合物の調製中など、室温などの低温でのみアニール（図のステップ I）する可能性があります。PCRで使用されるDNAポリメラーゼは約70℃で最も活性ですが、より低い温度でもある程度重合活性があり、互いにアニールした後にプライマーからDNA合成を引き起こす可能性があります。^[3]反応が60〜70℃の動作温度に達するまでPDの形成を防ぐためのいくつかの方法が開発されており、これにはDNAポリメラーゼの初期阻害、または反応混合物がより高い温度に達するまで反応成分反応を物理的に分離することが含まれます^{[説明が必要] 。これらの方法は}ホットスタートPCRと呼ばれます。

ワックス：この方法では、反応が高温に達すると溶けるワックスによって酵素が反応混合物から空間的に分離されます。^[4]

マグネシウムの徐放：DNAポリメラーゼは活性のためにマグネシウムイオンを必要とするため^[5]、マグネシウムは化学化合物に結合することで反応から化学的に分離され、高温でのみ溶液中に放出される^[6]。

阻害剤の非共有結合：この方法では、ペプチド、抗体^[7]、またはアプタマー^[8]が低温で酵素に非共有結合し、その活性を阻害します。95℃で1～5分間インキュベートすると、阻害剤が放出され、反応が始まります。

低温感受性Taqポリメラーゼ：低温ではほとんど活性を持たない改変DNAポリメラーゼ。^[9]

化学修飾：この方法では、小分子がDNAポリメラーゼの活性部位のアミノ酸の側鎖に共有結合する。反応混合物を95℃で10～15分間インキュベートすると、小分子は酵素から放出される。小分子が放出されると、酵素は活性化される。^[10]

PD の形成を防止または軽減する別のアプローチは、プライマー自体またはプライマー同士のアニーリングによって伸長が発生しないようにプライマーを変更することです。

HANDS（ホモタグアシスト非二量体システム[ 11 ^] ）：プライマーの3'末端に相補的なヌクレオチドテールをプライマーの5'末端に付加する。5'テールはプライマーの3'末端に近接しているため、アニールする。その結果、短いオーバーラップを含むアニーリングを排除するが、プライマーがターゲット内の完全に相補的な配列にアニーリングすることを可能にする ステムループプライマーが得られる。

キメラプライマー：プライマー内の一部のDNA塩基がRNA塩基に置き換えられ、キメラ配列が形成される。キメラ配列と別のキメラ配列の融解温度は、キメラ配列とDNAの融解温度よりも低い。この違いにより、プライマーが標的配列にアニールし、他のキメラプライマーにはアニールしないようにアニーリング温度を設定することができる。^[12]

ブロック切断プライマー： RNase H依存性PCR（rhPCR）として知られる方法^[13]では、耐熱性RNase HIIを使用して、高温でPCRプライマーからブロッキング基を除去します。このRNase HII酵素は低温ではほとんど活性を示さないため、ブロックの除去は高温でのみ発生します。この酵素は、プライマー：テンプレートのミスマッチ識別を本質的に備えているため、プライマーダイマーに対する追加の選択が行われます。

自己回避分子認識システム：SAMRSとしても知られる^[14]は、プライマーにヌクレオチド類似体T*、A*、G*、C*を導入することでプライマー二量体を排除します。SAMRS DNAは天然DNAに結合できますが、同じSAMRS種の他のメンバーには結合できません。たとえば、T*はAに結合できますがA*には結合できず、A*はTに結合できますがT*には結合できません。したがって、注意深い設計により、^[15] SAMRSから構築されたプライマーはプライマー間の相互作用を回避し、感度の高いSNP検出とマルチプレックスPCRを可能にします。

上記の方法はPD形成を減らすように設計されていますが、別のアプローチは定量PCRでPDから生成される信号を最小限に抑えることを目的としています。このアプローチは、形成されるPDが少なく、産物の蓄積に対する阻害効果が小さい限り有効です。

4ステップPCR：SYBR Green Iなどの非特異的色素を使用する場合に使用されます。PDと標的配列の長さ、したがって融解温度が異なることに基づいています。この方法では、シグナルは標的配列の融解温度よりも低いが、PDの融解温度よりも高い温度で取得されます。^[16]

配列特異的プローブ: TaqManおよび分子ビーコンプローブは、ターゲット (相補的) 配列が存在する場合にのみシグナルを生成し、この強化された特異性により、PD からのシグナル取得が防止されます (ただし、生成物の蓄積に対する阻害効果は防止されます)。

• 「プライマーダイマー予測のためのオンラインソフトウェア」。OligoAnalyzer 3.1。Integrated DNA Technologies 。
• 「プライマー設計。プライマーダイマーとは何ですか?」。YouTubeビデオ。2013 年 11 月 3 日。2021 年 12 月 20 日にオリジナルからアーカイブされました。