分子ビーコン

分子ビーコン、または分子ビーコンプローブは、均質な溶液中の特定の核酸の存在を報告できるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブです。分子ビーコンは、内部で消光した蛍光体を持つヘアピン型分子で、標的核酸配列に結合するとその蛍光が回復します。これは、特定の核酸配列を検出するための新しい非放射性方法です。これらは、プローブと標的のハイブリッドをハイブリダイゼーションプローブの過剰から分離することが不可能または望ましくない場合に役立ちます。

分子ビーコンプローブ

典型的な分子ビーコンプローブは25ヌクレオチド長です。^[要出典]中央の15ヌクレオチドは標的DNAまたはRNAに相補的で、互いに塩基対を形成せず、一方、各末端の5ヌクレオチドは標的DNAではなく、互いに相補的です。典型的な分子ビーコン構造は4つの部分に分けることができます: 1) ループ、標的配列に相補的な分子ビーコンの18～30塩基対領域。2) 互いに相補的な2つの短い(5～7ヌクレオチド残基)オリゴヌクレオチドがループの両端に結合して形成されるステム。3) 分子ビーコンの5'末端の5'蛍光体、蛍光色素が共有結合しています。4) 分子ビーコンの3'末端に共有結合している3'消光剤(非蛍光)色素。ビーコンが閉ループ形状の場合、消光剤は蛍光体の近くに存在し、蛍光体の蛍光発光を消光します。

検出対象の核酸がループ内の鎖と相補的である場合、ハイブリダイゼーションイベントが発生します。核酸とループの間に形成される二重鎖は、前者の二重鎖の方が塩基対が多いため、ステムの二重鎖よりも安定しています。これによりステムが分離し、蛍光体と消光剤が分離します。蛍光体が消光剤の隣になくなると、ハイブリッドに光を当てると蛍光が放出されます。放出があることで、ハイブリダイゼーションイベントが発生し、ターゲット核酸配列がテストサンプルに存在することが示されます。

細胞工学における使用

蛍光シグナル伝達オリゴヌクレオチドプローブは、ヘテロ多量体上皮性ナトリウムチャネル（αβγ-ENaC）、ナトリウム電位依存性イオンチャネル1.7（NaV1.7-αβ1β2）、4つのユニークなγ-アミノ酪酸A（GABAA）受容体イオンチャネルサブユニットの組み合わせα1β3γ2s、α2β3γ2s、α3β3γ2s、α5β3γ2s、嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子（CFTR）、CFTR-Δ508、および2つのGタンパク質共役受容体（GPCR）を発現する多遺伝子安定細胞株の生成を含む、1つ以上の目的遺伝子を発現する細胞を検出および分離するために使用できることが報告されています。^[1]

合成

分子ビーコンは、その調製方法が十分に文書化されている合成オリゴヌクレオチドです。合成には、従来のヌクレオシドホスホラミダイトセットに加えて、消光剤で誘導体化された固体支持体と、保護された蛍光色素を結合するように設計されたホスホラミダイト構成要素も必要です。

分子ビーコン、合成、機能の実証という用語が最初に使われたのは1996年でした。^[2]

代替の均質アッセイ技術

5'-ヌクレアーゼTaqManアッセイ^[3]
励起子制御ハイブリダイゼーション感受性蛍光オリゴヌクレオチド（ECHO）プローブ。^[4]
デュアルハイブリダイゼーション（LightCycler®）プローブ
スコーピオンズ®プローブ
LUX (Light Upon Extension) プローブ
DNA 結合色素アッセイ (例: SYBR Green、SYTO9、Melt Doctor、LCGreen Plus など)

アプリケーション

SNP検出^[3]
リアルタイム核酸検出
リアルタイムPCR定量
対立遺伝子の識別と同定^[3]
マルチプレックスPCRアッセイ
診断臨床検査

参考文献

^ Shekdar K、Langer J、Venkatachalan S、Schmid L 、 Anobile J、Shah P、et al. (2021年3月)。「蛍光オリゴヌクレオチドシグナルプローブとフローサイトメトリーを使用した細胞工学法」。バイオテクノロジーレター。43 (5):949–958。doi : 10.1007 /s10529-021-03101-5。PMC 7937778。PMID 33683511。
^ Tyagi S、 Kramer FR (1996 年 3 月)。「分子ビーコン: ハイブリダイゼーション時に蛍光を発するプローブ」。Nature Biotechnology 14 ( 3): 303–8。doi :10.1038/nbt0396-303。PMID 9630890。S2CID 27010207。
^ abc Täpp I、Malmberg L、Rennel E、Wik M、Syvänen AC (2000 年 4 月)。「一塩基多型の均一スコアリング: 5'-ヌクレアーゼ TaqMan アッセイと Molecular Beacon プローブの比較」。BioTechniques . 28 ( 4): 732–8. doi : 10.2144/00284rr02 . PMID 10769752。
^ Okamoto A (2011年12月). 「ECHOプローブ：実用的な核酸センシングのための蛍光制御の概念」. Chemical Society Reviews . 40 (12): 5815–28. doi :10.1039/c1cs15025a. PMID 21660343.

[1] ^ Shekdar K、Langer J、Venkatachalan S、Schmid L 、 Anobile J、Shah P、et al. (2021年3月)。「蛍光オリゴヌクレオチドシグナルプローブとフローサイトメトリーを使用した細胞工学法」。バイオテクノロジーレター。43 (5):949–958。doi : 10.1007 /s10529-021-03101-5。PMC 7937778。PMID 33683511。

[2] ^ Tyagi S、 Kramer FR (1996 年 3 月)。「分子ビーコン: ハイブリダイゼーション時に蛍光を発するプローブ」。Nature Biotechnology 14 ( 3): 303–8。doi :10.1038/nbt0396-303。PMID 9630890。S2CID 27010207。

[snp-3] Täpp I、Malmberg L、Rennel E、Wik M、Syvänen AC (2000 年 4 月)。「一塩基多型の均一スコアリング: 5'-ヌクレアーゼ TaqMan アッセイと Molecular Beacon プローブの比較」。BioTechniques . 28 ( 4): 732–8. doi : 10.2144/00284rr02 . PMID 10769752。

[4] Okamoto A (2011年12月). 「ECHOプローブ：実用的な核酸センシングのための蛍光制御の概念」. Chemical Society Reviews . 40 (12): 5815–28. doi :10.1039/c1cs15025a. PMID 21660343.