マイクロアレイ解析技術

2 つの異なるアレイまたは同じアレイにハイブリダイズされた 2 つの異なるサンプルを比較する場合、一般的には手順の違いや色素強度効果によって生じる系統誤差の調整が必要になります。2 色のアレイの色素正規化は、多くの場合、局所回帰によって行われます。LIMMA は、背景補正とスケーリングのためのツールセットと、スライド上の重複スポットを平均化するオプションを提供します。^{[ 5 ]}アレイの正規化がどの程度適切かを評価する一般的な方法は、データのMA プロットを作成することです。MA プロットは、R や MATLAB などのプログラムや言語を使用して作成できます。^{[ 6 ] [ 7 ]}

生の Affy データには、同じ RNA ターゲットに対して約 20 個のプローブが含まれています。これらの半分は、ターゲット配列と正確に一致しない「ミスマッチ スポット」です。これらは、理論的には、特定のターゲットに対する非特異的結合の量を測定することができます。ロバスト マルチ アレイ平均 (RMA) ^{[ 8 ]}は、これらのミスマッチ スポットを利用しない正規化アプローチですが、メディアン ポリッシュによって完全な一致を要約する必要があります。^{[ 9 ]}メディアン ポリッシュ アルゴリズムは、ロバストではありますが、分析されたサンプルの数によって動作が異なります。^{[ 10 ]}また、RMA の一部である分位点正規化は、さらなる比較を意味のあるものにするために、アレイのバッチを正規化する合理的なアプローチの 1 つです。

完全一致プローブと不一致プローブの両方を使用する現在のアフィメトリクスMAS5アルゴリズムは、引き続き人気があり、直接比較テストで良好な結果を示しています。^{[ 11 ]}

頑健なマイクロアレイ要約のための因子分析（FARMS） ^{[ 12 ]}は、完全一致プローブレベルでアレイデータを要約するためのモデルベースの手法です。これは、ガウス測定ノイズの仮定の下でベイズ最大事後確率法によってモデルパラメータを最適化する因子分析モデルに基づいています。Affycompベンチマーク^{[ 13 ]}によると、FARMSは感度と特異度に関して他のすべての要約手法を上回りました。

異常なレベルの過剰発現または低発現を示すアレイプローブを特定するための戦略は数多く存在する。最も単純な方法は、処理群間で平均で少なくとも2倍異なるプローブを「有意」とみなすことである。より洗練されたアプローチは、効果量と変動性の両方を考慮に入れるt検定やその他のメカニズムに関連していることが多い。興味深いことに、特定の遺伝子に関連付けられたp値は、反復実験間でうまく再現されず、単純なフォールドチェンジによって生成されたリストの方がはるかに優れたパフォーマンスを示す。^{[ 14 ] [ 15 ]}これは、実験を行う目的が一般的な挙動を予測することにあるため、非常に重要な観察である。MAQCグループは、フォールドチェンジ評価と厳密でないp値カットオフを使用することを推奨しており、さらに、バックグラウンド補正とスケーリングプロセスの変更は、フォールドチェンジの差の順位に最小限の影響しか与えないが、p値には大きな影響を与えることを指摘している。^{[ 14 ]}

クラスタリングは、類似した発現パターンを持つ遺伝子をグループ化するために用いられるデータマイニング手法である。階層的クラスタリングとk平均法クラスタリングは、マイクロアレイ解析において広く用いられている手法である。

^{Ingenuity [ 21 ]}や Pathway studio ^{[ 22 ]}などの遺伝子ネットワーク解析用の商用システムは、最新の科学文献に基づいて、差次的発現遺伝子の視覚的表現を作成します。FunRich ^{[ 23 ]} 、 GenMAPP、Moksiskaanなどの非商用ツールも、1 つまたは複数のマイクロアレイ実験から取得した遺伝子ネットワークデータの整理と視覚化に役立ちます。Rプログラミング言語で書かれたBioconductorを通じて、さまざまなマイクロアレイ解析ツールが利用できます。よく引用される SAM モジュールやその他のマイクロアレイツール^{[ 24 ]}は、スタンフォード大学から入手できます。ハーバード大学と MIT からも別のセットが提供されています。^{[ 25 ]}

マイクロアレイ実験における遺伝子の過剰発現または低発現の程度を基準状態と比較して判定するための統計解析用特殊ソフトウェアツールも開発されており、特定の表現型に関連する遺伝子または遺伝子セットの特定に役立てられています。遺伝子セット濃縮解析（GSEA）として知られる解析方法の1つは、コルモゴロフ・スミルノフ型の統計を使用して、一緒に制御されている遺伝子のグループを特定します。^{[ 1 ]}このサードパーティの統計パッケージは、NCBIのGenBankなどのデータベースのエントリや、Biocarta ^{[ 26 ]}やGene Ontologyなどのキュレーションされたデータベースへのリンクを含め、関心のある遺伝子または遺伝子セットに関する情報をユーザーに提供します。タンパク質複合体濃縮解析ツール（COMPLEAT）は、タンパク質複合体のレベルで同様の濃縮解析を提供します。^{[ 27 ]}このツールは、さまざまな条件または時点における動的なタンパク質複合体制御を特定できます。関連システムであるPAINT ^{[ 28 ]}とSCOPE ^{[ 29 ]}は、遺伝子プロモーター領域で統計分析を実行し、以前に特定された転写因子応答要素の過剰表現と過少表現を特定します。別の統計分析ツールは、ランク和確率分布関数を使用して実験データを説明する遺伝子セットを見つけるRank Sum Statistics for Gene Set Collections (RssGsc)です。^{[ 30 ]}さらに別のアプローチとして、コンテキストメタ分析、つまり遺伝子クラスターがさまざまな実験コンテキストにどのように反応するかを調べる方法があります。Genevestigatorは、解剖学的部位、発生段階、疾患、化学物質、ストレス、新生物への反応などのコンテキスト全体にわたるコンテキストメタ分析を実行するための公開ツールです。

• オリゴヌクレオチドおよびcDNAプライマーを用いたDNAマイクロアレイ、SNPアレイ、タンパク質アレイなど、マイクロアレイ実験を実施します。これにより、遺伝子発現、遺伝的変異、またはタンパク質間相互作用のハイスループット解析が可能になります。
• Microsoft Excel の入力式分析 — 下記参照
• SAMをMicrosoft Excelアドインとして実行する
• Delta チューニング パラメータを調整して、許容可能な偽発見率 (FDR) とともに有意な数の遺伝子を取得し、SAM Plot Controller で発現の平均差を計算してサンプル サイズを評価します。
• 発現差のある遺伝子（正に発現している遺伝子と負に発現している遺伝子）を一覧表示する

• SAMは、登録手続きを完了後、学術ユーザーおよび非学術ユーザー向けにhttp://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/からオンラインでダウンロードできます。
• SAMはExcelアドインとして実行され、SAMプロットコントローラーでは偽発見率とデルタをカスタマイズできます。また、SAMプロットとSAM出力機能では、有意遺伝子のリスト、デルタテーブル、およびサンプルサイズの評価が生成されます。
• 順列はサンプル数に基づいて計算されます
• ブロック順列
  • ブロックはマイクロアレイのバッチです。たとえば、8 つのサンプルを 2 つのグループ (コントロールと罹患) に分割すると、各ブロックに 4!=24 通りの順列があり、順列の総数は (24)(24)= 576 通りになります。最低 1000 通りの順列が推奨されます。^{[ 32 ] [ 36 ] [ 37 ]}

SAMを実行するデータセットに正しい値を代入する際に、順列の数はユーザーによって設定されます。

SAMは、発現データの順列解析に基づいて遺伝子発現の相対差の検定統計量を計算し、偽発見率を計算します。プログラムの主な計算は以下に示されています。^{[ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]}

定数s o_は、 d _iの変動係数を最小化するように選択されます。r _{i は}、 y 実験条件下における遺伝子iの発現レベル (x) に等しくなります。

${\displaystyle \mathrm {偽発見率 (FDR) = {\frac {誤って検出された遺伝子数の中央値 (または 90 パーセンタイル) / 有意と判定された遺伝子数}}} }$

フォールドチェンジ（t）は、有意な変化を示す遺伝子が、少なくとも事前に指定された量だけ変化することを保証するものです。つまり、2つの条件それぞれにおける遺伝子の平均発現レベルの絶対値は、正の変化を示すためにはフォールドチェンジ（t）よりも大きく、負の変化を示すためにはフォールドチェンジ（t）の逆数よりも小さくなければなりません。

SAMアルゴリズムは次のように表すことができます。

1. 検定統計量を大きさ順に並べる^{[ 33 ] [ 34 ]}
2. 各順列について、順序付けられたヌル（影響を受けない）スコアを計算します^{[ 33 ] [ 34 ]}
3. 順序付き検定統計量を期待される帰無スコアに対してプロットします^{[ 33 ] [ 34 ]}
4. 各遺伝子の検定統計量の絶対値からその遺伝子の平均検定統計量を引いた値が規定の閾値よりも大きい場合、その遺伝子は有意であると判断します^{[ 34 ]。}
5. 期待値と観測値に基づいて偽発見率を推定する^{[ 33 ] [ 34 ]}

• SAMでは、オリゴまたはcDNAアレイ、SNPアレイ、タンパク質アレイなどのデータを利用できます^{[ 33 ] [ 34 ]。}
• 発現データと臨床パラメータを相関させる^{[ 35 ]}
• 発現データと時間を相関させる^{[ 32 ]}
• データ順列を使用して多重検定の偽発見率を推定します^{[ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 38 ]}
• 局所的な偽発見率（その遺伝子と同様のd _iを持つ遺伝子のFDR ） ^{[ 32 ]}とミス率^{[ 32 ] [ 33 ]を報告する。}
• 異なるバッチのアレイ内で処理が適用される場合にブロック設計で機能する^{[ 32 ]}
• 有意とみなされる遺伝子の数を決定する閾値を調整できます^{[ 32 ]}

アレイ全体には、目視検査、同じ実験グループ内のアレイとのペアワイズ比較、またはRNA分解の分析によって検出可能な明らかな欠陥がある可能性があります。^{[ 39 ]}これらのアレイを分析から完全に除外することで、結果が改善される可能性があります。

アレイの種類によっては、蛍光色素の非特異的結合に関連するシグナルを差し引くことで、より良い結果が得られます。1つのアプローチは、スポット間の領域の平均シグナル強度を差し引くことです。バックグラウンド補正とさらなる解析のためのさまざまなツールが、TIGR ^{[ 40 ]} 、 Agilent ( GeneSpring ) ^{[ 41 ]} 、およびOcimum Bio Solutions (Genowiz) ^{[ 42 ]}から入手可能です。

印刷不良や洗浄不良などの局所的な欠陥を視覚的に確認することで、個々のスポットを除去する必要性が示唆される場合もある。アレイの製造品質によっては、これにはかなりの時間を要する可能性がある。さらに、一部の手順では、特定の強度閾値以下の発現値を持つすべてのスポットを除去する必要がある。