微結晶電子回折

マイクロ結晶電子回折法（MicroED）^{[1] [2]}は、2013年後半にハワード・ヒューズ医学研究所のジャネリア研究キャンパスのゴネン研究室で開発されたクライオ電子顕微鏡法です。MicroED は、薄い 3D 結晶を使用して電子回折によって構造を決定する電子結晶構造解析の一種です。このデモンストレーション以前は、高分子（タンパク質）電子結晶構造解析は主に 2D 結晶などで使用されていました。^{[3] [4]この方法は、}電子回折を使用して原子構造を決定するアプローチの最新バージョンの 1 つであり、1933 年に WE Laschkarew と ID Usykin によって NH4Cl 結晶の水素原子の位置に対して初めて実証されました。^{[5]この方法は、その後、}歳差電子回折^[6]を介して表面に使用されてきました。^[7]初期の研究の多くは、Boris Vainshtein ^[8]とDouglas L. Dorsetの研究で説明されています。^[9]

この方法は、サイズが小さいために通常はX線回折に適さないナノ結晶からタンパク質の構造を決定するために開発された。 ^[10] X線結晶構造解析に必要なサイズの10億分の1の結晶から、高品質のデータが得られる。^[11]他のすべてのCryoEMモダリティと同様にサンプルは凍結水和されるが、透過型電子顕微鏡（TEM）をイメージングモードで使用する代わりに、低い電子露出（通常0.01 e ⁻ /Å ^{2 /s未満）で}回折モードで使用する。ナノ結晶は回折ビームにさらされ、連続的に回転する^[2]と同時に、回折は高速カメラで動画として収集される。^{[2]その後、マイクロEDデータは、構造分析と改良のために}X線結晶構造解析用のソフトウェアを使用して処理される。^[12]マイクロED実験で使用されるハードウェアとソフトウェアは標準的で、広く入手可能である。^{[13] [14]}

結晶構造を解くための電子回折は、電子回折の黎明期にまで遡ります。マイクロEDの最初の成功例は、2013年にGonen研究室^{[1]によって、} X線結晶構造解析における古典的な試験タンパク質であるリゾチームの構造について報告されました。

電子顕微鏡の設置とデータ収集のための詳細なプロトコルが公開されている。^[15]

マイクロEDデータは、透過型電子顕微鏡（極低温）を使用して収集されます。顕微鏡には選択領域アパーチャを装備できますが、選択領域アパーチャなしでもマイクロEDを行うことができます。凍結せずに構造がいくつか報告されていますが、放射線による損傷は最小限に抑えられ、小さな分子であっても極低温冷却を使用することでより高い解像度が得られる場合があります。^[16]

マイクロED実験では、電子回折データを収集するためにさまざまな検出器が使用されてきました。電荷結合素子（CCD）と相補型金属酸化膜半導体（CMOS）技術を利用した検出器が使用されてきました。CMOS検出器では、個々の電子数を解釈することができます。^[17]最近では、直接電子検出器が線形モードと計数モードの両方で効果的に使用されています。^{[18] [19]}これらの例では、電子カウントにより、タンパク質中の水素の第一原理位相決定と可視化が可能になりました。

MicroED に関する最初の概念実証論文では、リゾチーム結晶が使用されました。^[1]フレーム間の間隔が 1 度ずつ、1 つのナノ結晶から最大 90 度のデータが収集されました。各回折パターンは、約 0.01 e ⁻ /Å ² /s の超低線量率で収集されました。3 つの結晶からのデータを統合して^[20]、優れた改良統計値を持つ 2.9Å の解像度の構造が得られ、極低温条件下で 3D マイクロ結晶から線量感受性タンパク質の構造を決定できるようになりました。

MicroEDはデータ収集中に連続回転を使用します。^[2]ここでは、結晶が一方向にゆっくりと回転し、回折が高速カメラで動画として記録されます。これにより、データ品質がいくつか改善され、標準的なX線結晶構造解析ソフトウェアを使用したデータ処理が可能になりました。^[2]連続回転MicroEDは逆格子空間のサンプリングを改善します。^[21]

マイクロEDデータ処理の詳細なプロトコルが公開されている。^[12] 連続ステージ回転を使用してマイクロEDデータを収集する場合は、標準的な結晶構造解析ソフトウェア^[14]を使用することができる。

他に開発され、効果が実証されている電子回折法としては、自動回折トモグラフィー（ADT）^[22]や回転電子回折（RED ^[23]）などがある。これらの方法は、MicroEDとは少し異なる。ADTでは、動的な回折効果を減らすために、ビームの歳差運動と組み合わせて、ゴニオメーターの傾斜の離散的なステップを使用して逆格子空間をカバーする。^[22] ADTでは、歳差運動にハードウェアとソフトウェアを使用し、結晶追跡には走査透過型電子顕微鏡を使用する。^[22] REDはTEMで行われるが、ゴニオメーターは離散的なステップで傾斜し、ギャップを埋めるためにビームの傾斜を使用する。^[23] ADTとREDのデータを処理するためにソフトウェアを使用する。^[23]

マイクロEDは、大きな球状タンパク質^[24]、小さなタンパク質^[2]、ペプチド^[25] 、膜タンパク質^[ 26]、有機分子^{[27 ]、 [28]}、無機化合物^[29]の構造を決定するために使用されてきました。これらの例の多くでは、水素と荷電イオンが観察されました。^{[25] [26]}

MicroEDによって解明された最初の構造は、2015年後半に発表されました。^{[25]これらの構造は、}パーキンソン病の原因となるタンパク質であるα-シクレイン（α-synculein）の毒性コアを形成するペプチド断片の構造であり、毒性凝集体の凝集メカニズムへの洞察につながります。構造は1.4Åの解像度で解明されました。

MicroEDによって解明されたタンパク質の最初の新規構造は、2019年に発表されました。^[30]このタンパク質は、Sulfolobus acidocaldarius由来の金属酵素R2様リガンド結合酸化酵素（R2lox）です。構造は、既知の構造を持つ最も近い相同体から構築された35％の配列同一性を持つモデルを使用して分子置換により3.0Åの解像度で解明されました。

• 透過型電子顕微鏡の大手メーカーであるサーモフィッシャーサイエンティフィックによるマイクロEDの背景
  • MicroEDの開発とその応用に関するビデオインタビュー
• Janelia アーカイブの MicroED に関する背景
• ゴネン研究室のマイクロEDに関する背景と出版物