マイクロダイアリシス

マイクロダイアリシスは、ほとんどすべての組織の細胞外液中の遊離した非結合分析物濃度を連続的に測定するために使用される、低侵襲性のサンプリング技術です。分析物には、体内での生化学的機能を評価する内因性分子（神経伝達物質、ホルモン、グルコースなど）、または体内での分布を決定する外因性化合物（医薬品など）が含まれます。マイクロダイアリシス技術では、小さなマイクロダイアリシスカテーテル（マイクロダイアリシスプローブとも呼ばれる）を対象組織に挿入する必要があります。マイクロダイアリシスプローブは、毛細血管を模倣するように設計されており、先端に半透性中空繊維膜を備えたシャフトで構成され、入口チューブと出口チューブに接続されています。プローブには、周囲の組織液の（イオン）組成に非常によく似た水溶液（灌流液）が、約 0.1～5μL/分の低流量で連続的に灌流されます。 ^[1]対象となる組織または（体）液に挿入されると、小さな溶質は受動拡散によって半透膜を通過できます。分析対象物の流れの方向はそれぞれの濃度勾配によって決定され、マイクロダイアリシスプローブをサンプリングツールおよびデリバリーツールとして使用できるようになります。^[1]プローブから出た溶液（透析液）は、分析のために一定の時間間隔で収集されます。

マイクロダイアリシスの原理は、1960年代初頭に初めて採用されました。このとき、プッシュプルカニューレ^[2]と透析嚢^[3]が動物組織、特にげっ歯類の脳に埋め込まれ、組織の生化学を直接研究しました。^[1]これらの技術には、動物あたりのサンプル数や時間分解能がない/限られているなど、実験上の欠点がいくつかありましたが、1972年に連続灌流ダイアトロードが発明されたことで、これらの制限のいくつかを克服することができました。^[4]ダイアトロードの概念をさらに改良した結果、1974年に直径約200～300μmの管状の半透膜である「中空繊維」が発明されました。^[5]今日最も一般的な形状であるニードルプローブは、先端に中空繊維が付いたシャフトで構成され、ガイドカニューレを使用して脳やその他の組織に挿入できます。代替法であるオープンフローマイクロ灌流（OFM）では、膜を肉眼で見える開口部に置き換え、親油性^{[6] [7] [8]}および親水性化合物^{[9] 、タンパク質結合および非結合薬物[10] [11]} 神経伝達物質、ペプチドおよびタンパク質、抗体^{[12] [13] [14]} ナノ粒子およびナノキャリア、酵素および小胞のサンプリングを容易にします。

メンブレンとシャフトの長さの組み合わせが異なるさまざまなプローブが利用可能です。市販のマイクロダイアリシスプローブの分子量カットオフは約6〜100kDの広い範囲をカバーしていますが、1MDも利用可能です。水溶性化合物は一般にマイクロダイアリシスメンブレンを自由に拡散しますが、親油性の高い分析対象物の場合は状況がそれほど明確ではなく、成功したもの（コルチコステロイドなど）と失敗したもの（エストラジオール、フシジン酸など）の両方がマイクロダイアリシス実験で報告されています。^[15] ただし、分析対象の分子量がメンブレンの分子量カットオフの25%を超えると、水溶性化合物の回収率は通常急速に低下します。

マイクロ透析プローブは新鮮な灌流液で常に灌流されているため、完全な平衡は確立できません。 ^[1]この結果、透析液の濃度は、遠隔採取部位で測定された濃度よりも低くなります。透析液で測定された濃度を遠隔採取部位の濃度と相関させるには、較正係数（回収率）が必要です。^[16]回収率は、定常状態で、マイクロ透析膜を横切る分析物交換の一定速度を使用して決定できます。半透膜を横切る分析物の交換速度は、通常、分析物の抽出効率として表されます。抽出効率は、プローブを通過する際の分析物の損失/増加（C _in −C _out）と、灌流液と遠隔採取部位の濃度差（C _in −C _sample）との比として定義されます。

理論的には、マイクロダイアリシスプローブの抽出効率は、1) 流量を一定に保ちながら薬物濃度を変えるか、2) それぞれの薬物濃度を一定に保ちながら流量を変えることで決定できます。定常状態では、灌流液中の分析対象物が増加しても減少しても、同じ抽出効率値が得られます。^[1] したがって、マイクロダイアリシスプローブは、薬物を含む灌流液を使用して分析対象の損失を測定するか、薬物を含むサンプル溶液を使用して分析対象物の増加を測定することで較正できます。現在までに最も頻繁に使用されている較正方法は、低流量法、ノーネットフラックス法、^[17]動的（拡張）ノーネットフラックス法、^[18]および逆透析法です。^[19]適切な較正方法を正しく選択することは、マイクロダイアリシス実験の成功に非常に重要です。したがって、動物またはヒトで使用する前に、 補助的なin vitro実験を行うことが推奨されます。 ^[1] さらに、試験管内で測定された回収率はヒトでの回収率と異なる可能性がある。そのため、実際の値は生体内実験ごとに測定する必要がある。^[15]

低流量法は、抽出効率が流量に依存するという事実に基づいています。高流量では、単位時間あたりにサンプリング部位から透析液に拡散する薬剤の量は、低流量（高抽出効率）の場合よりも少なくなります（低抽出効率）。流量がゼロの場合、これら 2 つの部位の間で完全な平衡が確立されます（C _out = C _sample）。この概念は、プローブをさまざまな流量でブランク灌流液で灌流する（低）流量法に適用されます。サンプリング部位の濃度は、対応する流量に対する抽出率をプロットし、ゼロ流量に外挿することで決定できます。低流量法は、十分なサンプル量が収集されるまでのキャリブレーション時間がかなり長くなる可能性があるという事実によって制限されます。^{[引用が必要]}

ノーネットフラックス法によるキャリブレーション中、マイクロダイアリシスプローブは少なくとも4つの異なる濃度の対象分析物（C _in）で灌流され、プローブから出る分析物の定常濃度が透析液（C _out）で測定されます。^[17]この方法の回収率は、C _out −C _{in を}C _inでプロットし、回帰直線の傾きを計算することで決定できます。灌流液中の分析物濃度がサンプリング部位の濃度に等しい場合、ノーネットフラックスが発生します。ノーネットフラックスポイントでのそれぞれの濃度は、回帰直線のx切片によって表されます。この方法の強みは、定常状態では、特定の時間と場所で平衡が存在するため、プローブ付近の化合物の挙動について仮定する必要がないことです。^[15]しかし、過渡的な状況（例えば薬物投与後）では、プローブの回収率が変化する可能性があり、その結果、サンプリング地点での濃度の推定値が偏ってしまう。この制限を克服するために、非定常状態にも適用できるいくつかのアプローチが開発されている。これらのアプローチの1つは、動的ノーネットフラックス法である。^[18]

ノーネットフラックス法では、1人の被験者/動物に複数の濃度で灌流しますが、ダイナミックノーネットフラックス（DNNF）法では、複数の被験者に単一の濃度で灌流します。^[18]その後、異なる被験者/動物のデータを各時点で組み合わせて回帰分析を行い、時間の経過に伴う回復を判定します。DNNFキャリブレーション法の設計は、神経伝達物質などの内因性化合物の薬物負荷に対する反応を評価する研究に非常に有用であることが証明されています。^[18]

逆透析では、マイクロ透析プローブに分析対象物を含む溶液を灌流し、プローブからの薬物の消失をモニターする。この方法の回収率は、通過中に失われた薬物（C _in −C _out）とマイクロ透析プローブに入る薬物（C _in）の比として計算できる。原則として、逆透析は、分析対象物自体（薬物による逆透析）または分析対象の生理化学的特性と生物学的特性の両方に非常に類似した参照化合物（キャリブレーターによる逆透析）のいずれかを使用して実行できる。^[19]薬物による逆透析は、サンプル採取部位に分析対象物が存在しない必要があるため内因性化合物には使用できませんが、このキャリブレーション方法は、臨床現場では外因性化合物に最も一般的に使用されています。^[1]

マイクロダイアリシス技術は、1972年に初めて使用されて以来、脳内の内因性生体分子の濃度をモニタリングするために大きく発展してきました。 [ ^{4 ]}今日では、応用範囲はほぼあらゆる組織における内因性および外因性化合物の遊離濃度のモニタリングにまで拡大しています。マイクロダイアリシスは、主に前臨床動物研究（実験用げっ歯類、イヌ、ヒツジ、ブタなど）で使用されていますが、現在では、摂食や運動などの恒常性変動に反応して遊離した非結合薬物組織濃度や調節性サイトカインおよび代謝物の間質濃度をモニタリングするために、ヒトでもますます使用されています。^[21]

脳研究に用いられる場合、マイクロダイアリシスは、神経伝達物質（ドーパミン、セロトニン、ノルエピネフリン、アセチルコリン、^[22] グルタミン酸、GABA）とその代謝物、小さな神経調節物質（cAMP、cGMP、NO）、アミノ酸（グリシン、システイン、チロシン）、エネルギー基質（グルコース、乳酸、ピルビン酸）の測定によく使用されます。マイクロダイアリシスで分析される外因性薬物には、新しい抗うつ薬、抗精神病薬、抗生物質、および脳内に薬理学的効果部位を持つ他の多くの薬物が含まれます。ヒトの脳内で生体内でマイクロダイアリシスによって分析された最初の非代謝物はリファンピシンでした。^{[23] [24] [25]}

他の臓器への応用としては、皮膚（局所的に塗布された皮膚科用医薬品の生物学的利用能と生物学的同等性の評価） ^[26]や、糖尿病患者のグルコース濃度のモニタリング（血管内または皮下プローブの配置）などがある。後者は、自動インスリン投与用の人工膵臓システムに組み込むこともできる。

マイクロダイアリシスは環境研究でも応用が進んでおり、^[27]廃水や土壌溶液から糖類、^[28]金属イオン、^[29]微量栄養素、^[30]有機酸、^[31]低分子量窒素など多様な化合物を採取しています。^[32]従来の土壌サンプル採取法は破壊的な性質があるため、^[33]マイクロダイアリシスは土壌イオンのフラックスを推定し、撹乱されていない土壌環境をよりよく反映する可能性があります。

1. 現在までに、マイクロダイアリシスは、事実上あらゆる組織の細胞外液中の薬物または代謝物の濃度を継続的に監視できる唯一の生体内サンプリング技術です。具体的な用途に応じて、分析対象物の濃度は数時間、数日、または数週間にわたって監視できます。遊離した非結合細胞外組織濃度は、作用部位またはその近くの薬理学的に活性な濃度に似ているため、多くの場合特に重要です。マイクロダイアリシスと陽電子放出断層撮影などの最新の画像技術を組み合わせると、細胞内濃度をさらに測定できます。
2. 選択した組織の正確な位置にプローブを挿入すると、トランスポーターの活性や灌流の違いなどの他の要因による細胞外濃度勾配をさらに評価できるようになります。そのため、組織分布の研究に使用する最も適切な技術として提案されています。
3. 半透膜を介した分析物の交換と、サンプリング液を新鮮な灌流液で絶えず置換することで、サンプリング部位からの液体の流出を防ぎ、液体の損失なしにサンプリングを行うことができます。その結果、マイクロダイアリシスは、マイクロインジェクションやプッシュプル灌流などの他の技術を使用するときに発生する可能性のある局所的な液体の損失や圧力アーティファクトによって組織の状態を乱すことなく使用できます。
4. 半透膜は、細胞、細胞残骸、タンパク質が透析液に入るのを防ぎます。透析液にはタンパク質が含まれていないため、分析前のサンプルのクリーンアップは必要なく、酵素分解の心配もありません。

1. マイクロダイアリシスプローブをより小型かつ効率的にする科学的進歩にもかかわらず、この技術の侵襲性は依然としていくつかの実用的および倫理的限界をもたらしている。例えば、マイクロダイアリシスプローブの埋め込みは組織の形態を変化させ、微小循環、代謝率、または血液脳関門などの生理学的障壁の完全性を乱す可能性があることが示されている。^[34]埋め込み外傷などのプローブ挿入に対する急性反応には十分な回復時間が必要であるが、壊死、炎症反応、^[21]または創傷治癒プロセスなどの追加要因は実験結果に影響を及ぼす可能性があるため、長期サンプリングでは考慮する必要がある。実用的な観点から、マイクロダイアリシス実験は最適な時間枠内、通常はプローブ挿入後24〜48時間以内に行うことが提案されている。^{[35] [36]}
2. マイクロダイアリシスは、例えば電気化学バイオセンサーと比較すると、時間的および空間的な解像度が比較的低い。時間的解像度はサンプリング間隔の長さ（通常は数分）によって決まるが、空間的解像度はプローブの寸法によって決まる。プローブのサイズは適用領域によって異なり、長さは数ミリメートル（脳内適用）から数センチメートル（皮下適用）まで、直径は数百マイクロメートルの範囲をカバーします。^[要出典]
3. マイクロダイアリシス技術の応用は、特に生体内実験の場合、プローブの回収率の決定によって制限されることが多い。回収率の決定には時間がかかり、追加の被験者やパイロット実験が必要になる場合がある。回収率は流量に大きく依存し、流量が低いほど回収率は高くなる。しかし、実際には、分析用に得られるサンプル量が不十分になるか、実験の時間分解能が失われるため、流量をあまり下げることはできない。したがって、流量と分析アッセイの感度の関係を最適化することが重要である。親油性化合物の場合、チューブやその他のプローブ部品に付着して分析対象物の回収率が低下するか、まったく回収されない可能性があるため、状況はより複雑になる可能性がある。^[要出典]