クロマトグラフィー

化学分析において、クロマトグラフィーは混合物を成分に分離するための実験技術である。混合物は移動相と呼ばれる流体溶媒（気体または液体）に溶解され、移動相によって固定相と呼ばれる物質が固定されたシステム（カラム、毛細管、プレート、またはシート）に運ばれる。混合物の異なる成分は固定相に対して異なる親和性を持つ傾向があり、表面部位との相互作用に応じて異なる時間保持されるため、成分は移動流体中を異なる見かけの速度で移動し、分離する。分離は移動相と固定相の間の差動分配に基づいている。化合物の分配係数の微妙な違いは固定相での差動保持をもたらし、分離に影響を与える。^[1]

クロマトグラフィーには分取用と分析用の2種類がある。分取用クロマトグラフィーの目的は、混合物の成分を分離して後で使用することであり、精製の一種である。^{[2] [3]}このプロセスは、その製造方法のためコストが高くなる。^{[4] [2]}分析用クロマトグラフィーは通常、少量の物質で行われ、混合物中の分析対象物の存在を確認したり、その相対的な割合を測定したりする。この2つのタイプは相互に排他的ではない。^[5]

クロマトグラフィー（発音：/ ˌ k r oʊ m ə ˈ t ɒ ɡ r ə f i /）は、ギリシャ語のχρῶμα chrōma（「色」）と γράφειν gráphein （「書く」）に由来しています。この2つの用語の組み合わせは、生物学的色素を分離するために最初に使用された技術の発明から直接受け継がれました。^[6]

この方法は、 1901年から1905年にかけてカザン大学とワルシャワ大学で植物学者ミハイル・ツヴェットによって開発されました。^{[7] [8]}彼は20世紀の最初の10年間にこの技術を開発し、クロマトグラフィーという用語を作り出しました。主にクロロフィル、カロチン、キサントフィルなどの植物色素の分離に使用されました。これらの成分は異なる色（それぞれ緑、オレンジ、黄色）の帯に分離するため、この技術の名前の直接的なヒントとなりました。1930年代から1940年代にかけて新しいタイプのクロマトグラフィーが開発され、この技術は多くの分離プロセスに役立つようになりました。^[9]

クロマトグラフィー技術は、1940年代から1950年代にかけてのアーチャー・ジョン・ポーター・マーティンとリチャード・ローレンス・ミリントン・シングの研究の結果として大幅に発展し、1952年にノーベル化学賞を受賞しました。^{[10]彼らは分配クロマトグラフィーの原理と基本技術を確立し、その研究により、}ペーパークロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、そして高性能液体クロマトグラフィーとして知られるようになるいくつかのクロマトグラフィー法が急速に発展しました。それ以来、技術は急速に進歩しました。研究者たちは、ツヴェットのクロマトグラフィーの主な原理がさまざまな方法で応用できることを発見し、以下に説明するさまざまな種類のクロマトグラフィーを生み出しました。進歩によりクロマトグラフィーの技術的性能が継続的に向上し、ますます類似した分子の分離が可能になっています。

• 分析対象物– クロマトグラフィー中に分離される物質。通常は混合物から必要なものでもあります。
• 分析クロマトグラフィー– クロマトグラフィーを使用してサンプル内の分析対象物の存在と、場合によっては濃度も判定します。
• 結合相– 支持粒子またはカラムチューブの内壁に共有結合した固定相。
• クロマトグラム– クロマトグラフの視覚的な出力。分離が最適である場合、クロマトグラム上の異なるピークまたはパターンは、分離された混合物の異なる成分に対応します。
  
  X 軸には保持時間がプロットされ、Y 軸にはシステムから排出される分析対象物によって生成される応答に対応する信号 (たとえば、分光光度計、質量分析計、またはその他のさまざまな検出器によって取得される信号) がプロットされます。最適なシステムの場合、信号は分離された特定の分析対象物の濃度に比例します。
• クロマトグラフ– ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーによる分離など、高度な分離を可能にする機器。
• クロマトグラフィー – 成分を 2 つの相に分配して分離する物理的な方法。一方の相は静止しており (固定相)、もう一方の相は一定方向に移動しています (移動相)。
• 溶出液（溶出液と綴られることもある）は、溶出クロマトグラフィーで使用される溶媒または溶媒固定剤であり、移動相と同義である。^[11]
• 溶出液–カラムから排出される溶質（溶出液参照）と溶媒（溶出液参照）の混合物。 ^[11]
• 流出液– クロマトグラフィーカラムから流出する流れ。実際には溶出液と同義語として使用されますが、より正確には分離が行われるかどうかに関係なく流れを指します。^[11]
• 溶出物–溶質または分析物のより正確な用語。クロマトグラフィーカラムから排出されるサンプル成分です。^[11]
• 溶出能シリーズ- 溶出力に応じてランク付けされた溶媒のリスト。
• 固定相– 支持粒子上またはカラムチューブの内壁に固定された固定相。
• 移動相– 一定の方向に移動する相。移動相は、液体 (LC およびキャピラリー電気クロマトグラフィー、CEC)、気体 (GC)、または超臨界流体 (超臨界流体クロマトグラフィー、SFC) です。移動相は、分離/分析されるサンプルと、サンプルをカラムに通す溶媒で構成されます。HPLC の場合、移動相は、順相ではヘキサンなどの非極性溶媒、逆相クロマトグラフィーではメタノールなどの極性溶媒と、分離されるサンプルで構成されます。移動相はクロマトグラフィーカラム (固定相) を通過し、サンプルは固定相と相互作用して分離されます。
• 分取クロマトグラフィー– 分析ではなく、さらなる使用のために十分な量の物質を精製するためにクロマトグラフィーを使用すること。
• 保持時間– 特定の分析対象物が設定された条件下でシステム（カラム入口から検出器まで）を通過するのにかかる特性時間。参照:コヴァッツの保持指数
• サンプル– クロマトグラフィーで分析される物質。単一の成分で構成される場合もあれば、複数の成分の混合物である場合もあります。分析の過程でサンプルが処理される場合、対象の分析物を含む相または相はサンプルと呼ばれますが、分析の前または分析の過程でサンプルから分離された対象以外のすべてのものは廃棄物と呼ばれます。
• 溶質– 分配クロマトグラフィーにおけるサンプル成分。
• 溶媒– 他の物質を溶解することができる物質、特に液体クロマトグラフィーにおける液体移動相。
• 固定相– クロマトグラフィーの手順のために固定された物質。例としては、薄層クロマトグラフィーのシリカ層などがある。
• 検出器– 分離後の分析対象物の定性的および定量的な検出に使用される機器。

クロマトグラフィーは、分配係数の概念に基づいています。任意の溶質は、2 つの混ざらない溶媒の間で分配されます。1 つの溶媒を固定し (固体支持マトリックスに吸着)、もう 1 つの溶媒を移動可能にすると、クロマトグラフィーの最も一般的な用途になります。マトリックス サポート、つまり固定相が極性 (セルロース、シリカなど) である場合は、順相クロマトグラフィーです。それ以外の場合は、この技術は逆相として知られ、非極性固定相 ( C-18の非極性誘導体など) が使用されます。

カラムクロマトグラフィーは、固定床がチューブ内にある分離技術です。固体固定相の粒子または液体固定相でコーティングされた支持体は、チューブの内部容積全体を満たすか（充填カラム）、またはチューブの内壁上または内壁に沿って濃縮され、チューブの中央部分に移動相のための開いた制限のない経路を残します（オープンチューブラーカラム）。媒体を通る移動速度の差は、サンプルの異なる保持時間として計算されます。^{[12] [13]} 1978年、W. Clark Stillはフラッシュカラムクロマトグラフィー（フラッシュ）と呼ばれるカラムクロマトグラフィー の修正版を発表しました。 ^{[14] [15]}この技術は、溶媒が正圧をかけてカラムを通過することを除けば、従来のカラムクロマトグラフィーと非常によく似ています。これにより、ほとんどの分離を20分未満で実行でき、古い方法と比較して分離が改善されました。現代のフラッシュクロマトグラフィーシステムは、事前にパックされたプラスチックカートリッジとして販売されており、溶媒はカートリッジを介してポンプで送られます。システムは、自動化を提供する検出器やフラクションコレクターとリンクすることもできます。グラジエントポンプの導入により、分離が速くなり、溶媒の使用量が減りました。

拡張床吸着では、充填床によって作られた固相ではなく、流動床が使用されます。これにより、培養液や破砕した細胞のスラリーの遠心分離や濾過などの初期の浄化ステップを省略できます。

ホスホセルロースクロマトグラフィーは、多くのDNA結合タンパク質のホスホセルロースに対する結合親和性を利用する。タンパク質とDNAの相互作用が強いほど、そのタンパク質を溶出するために必要な塩濃度が高くなります。^[16]

平面クロマトグラフィーは、固定相が平面として、または平面上に存在する分離技術です。平面は紙で、そのままの形で使用することも、固定床として物質を含浸させたもの (ペーパークロマトグラフィー) や、ガラス板などの支持体上に広げられた固体粒子の層 (薄層クロマトグラフィー) として使用することもできます。サンプル混合物中のさまざまな化合物は、移動相と比較して固定相と相互作用する強さに応じて、異なる距離を移動します。各化学物質の特定の保持係数(R _f ) は、未知の物質の識別に役立てることができます。

ペーパークロマトグラフィーは、クロマトグラフィー紙の細片にサンプル溶液を小さな点または線で付ける技術です。紙は、溶媒の薄い層が入った容器に入れられ、密封されます。溶媒が紙を通過して上昇すると、サンプル混合物と出会い、サンプル混合物は溶媒とともに紙を上昇し始めます。この紙は極性物質であるセルロースでできており、混合物内の化合物は極性が低いほど遠くまで移動します。極性物質はセルロース紙とより速く結合するため、それほど遠くまで移動しません。

薄層クロマトグラフィー（TLC）は、固定相と移動相に対する相対的な吸引力に基づいてさまざまな生化学物質を分離するために使用される、広く使用されている実験技術です。紙クロマトグラフィーに似ています。ただし、紙の固定相を使用する代わりに、平らな不活性基板上のシリカゲル、アルミナ、またはセルロースなどの吸着剤の薄い層の固定相を使用します。TLCは非常に汎用性が高く、複数のサンプルを同じ層で同時に分離できるため、薬物レベルや水の純度をテストするなどのスクリーニングアプリケーションに非常に便利です。^[17]

各分離は新しい層で行われるため、相互汚染の可能性は低いです。紙と比較すると、実行が速く、分離が優れ、定量分析が優れ、さまざまな吸着剤を選択できるという利点があります。より少ない溶媒でさらに優れた解像度とより速い分離を実現するには、高性能 TLC を使用できます。以前は、ゲル内の距離を観察して染色体を区別する用途が一般的でした (分離は別のステップでした)。

置換クロマトグラフィーの基本原理は、クロマトグラフィーマトリックスに対する親和性の高い分子（置換体）が結合部位を効果的に競合し、親和性の低い分子をすべて置換するというものである。^[18] 置換クロマトグラフィーと溶出クロマトグラフィーには明確な違いがある。溶出モードでは、物質は通常、狭いガウス分布のピークとしてカラムから出てくる。精製を最大限に高めるには、できればベースラインまでの広いピーク分離が望ましい。溶出モードで混合物の成分がカラムを移動する速度は、多くの要因に依存する。しかし、2 つの物質が異なる速度で移動し、それによって分離されるためには、生体分子とクロマトグラフィーマトリックス間の何らかの相互作用にかなりの差がなければならない。この差の効果を最大化するために、操作パラメータが調整される。多くの場合、ピークのベースライン分離は、グラジエント溶出と低いカラム負荷でのみ達成できる。したがって、特に分取スケールでの溶出モードクロマトグラフィーの 2 つの欠点は、グラジエント溶媒ポンピングによる操作の複雑さと、低いカラム負荷によるスループットの低さである。置換クロマトグラフィーは、成分が「ピーク」ではなく、純粋な物質の連続したゾーンに分解される点で、溶出クロマトグラフィーよりも優れています。このプロセスは等温線の非線形性を利用するため、特定のカラムでより大きなカラムフィードを分離でき、精製された成分が著しく高い濃度で回収されます。

ガスクロマトグラフィー (GC) は、ガス液体クロマトグラフィー (GLC) とも呼ばれ、移動相がガスである分離技術です。ガスクロマトグラフィー分離は常にカラムで行われ、通常は「パック」または「キャピラリー」です。パックカラムはガスクロマトグラフィーの定番の主力製品で、安価で使いやすく、十分な性能を発揮することがよくあります。キャピラリーカラムは一般にはるかに優れた分解能を提供し、より高価ではありますが、特に複雑な混合物の場合に広く使用されるようになっています。さらに、キャピラリーカラムは、多孔質層オープンチューブラー (PLOT)、壁コーティングオープンチューブラー (WCOT)、およびサポートコーティングオープンチューブラー (SCOT) カラムの 3 つのクラスに分けられます。PLOT カラムは、固定相がカラム壁に吸着される点で独特ですが、WCOT カラムは壁に化学的に結合された固定相を持っています。SCOT カラムは、ある意味では前述の 2 つのタイプの組み合わせで、サポート粒子がカラム壁に付着していますが、その粒子に液相が化学的に結合されています。^[19]どちらのタイプのカラムも非吸着性で化学的に不活性な材料で作られています。充填カラムの場合はステンレス鋼とガラスが、毛細管カラムの場合は石英または溶融シリカが通常の材料です。

ガスクロマトグラフィーは、固体または粘性液体の固定相（多くの場合、液体シリコンベースの材料）と可動性ガス（ほとんどの場合、ヘリウム）との間の分析物の分配平衡に基づいています。固定相は、小径（通常、内径 0.53 - 0.18 mm）のガラスまたは溶融シリカチューブ（キャピラリーカラム）の内側、またはより大きな金属チューブ（パックドカラム）内の固体マトリックスに付着しています。分析化学で広く使用されています。GCで使用される高温は、生化学で頻繁に遭遇する高分子量のバイオポリマーまたはタンパク質（熱によって変性する）には適していませんが、石油化学、環境モニタリングおよび修復、および工業化学の分野での使用に適しています。化学研究でも広く使用されています。

液体クロマトグラフィー (LC) は、移動相が液体である分離技術です。カラムまたは平面で実行できます。一般に非常に小さな充填粒子と比較的高い圧力を利用する現在の液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィーと呼ばれています。

HPLC では、サンプルは高圧の液体 (移動相) によって、不規則な形状または球形の粒子、多孔質モノリス層、または多孔質膜で構成された固定相が詰められたカラムに押し込まれます。モノリスは「スポンジのようなクロマトグラフィー媒体」^[2]であり、有機または無機部分の無限のブロックで構成されています。HPLC は歴史的に、移動相と固定相の極性に基づいて 2 つの異なるサブクラスに分類されています。固定相が移動相よりも極性が高い方法 (例:移動相がトルエン、固定相がシリカ) は順相液体クロマトグラフィー (NPLC) と呼ばれ、その逆の方法 (例: 移動相が水とメタノールの混合物、固定相が C18 (オクタデシルシリル)) は逆相液体クロマトグラフィー (RPLC) と呼ばれます。

超臨界流体クロマトグラフィーは、移動相が臨界温度と臨界圧力よりも高い比較的近い温度と圧力の流体である分離技術です。

この広い見出しの下にある具体的なテクニックを以下に示します。

アフィニティークロマトグラフィー^[20]は、分析対象物と特定の分子との間の選択的な非共有結合相互作用に基づいています。これは非常に特異的ですが、それほど堅牢ではありません。^[21]これは、タグに結合したタンパク質の精製において生化学でよく使用されます。これらの融合タンパク質は、固定相に特異的に結合するHisタグ、ビオチン、抗原などの化合物で標識されます。精製後、これらのタグは通常除去され、純粋なタンパク質が得られます。

アフィニティークロマトグラフィーは、多くの場合、生体分子の金属陽イオン（Zn、Cu、Feなど）に対する親和性を利用します。カラムは手動で準備されることが多く、目的のタンパク質専用に設計されることもあります。従来のアフィニティーカラムは、不要な生体分子を洗い流すための準備ステップとして、または物理的特性が不明なタンパク質を分析するための主要なステップとして使用されます。^[22]

しかし、アフィニティークロマトグラフィーの特性を利用した液体クロマトグラフィー技術は存在します。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）^{[23] [24]}は、金属に対する相対的な親和性に基づいて前述の分子を分離するのに役立ちます。多くの場合、これらのカラムに異なる金属をロードして、目的の親和性を持つカラムを作成できます。^[25]

イオン交換クロマトグラフィー（通常イオンクロマトグラフィーと呼ばれる）は、イオン交換メカニズムを使用して、それぞれの電荷に基づいて分析対象物を分離します。通常はカラムで実行されますが、平面モードでも役立ちます。イオン交換クロマトグラフィーは、荷電固定相を使用して、陰イオン、陽イオン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質などの荷電化合物を分離します。従来の方法では、固定相は、化合物の反対の電荷を持つ基と相互作用して保持する荷電官能基を持つイオン交換樹脂です。イオン交換クロマトグラフィーには、陽イオン交換と陰イオン交換の2種類があります。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、固定相は負に帯電し、交換可能なイオンは陽イオンですが、陰イオン交換クロマトグラフィーでは、固定相は正に帯電し、交換可能なイオンは陰イオンです。^{[26]イオン交換クロマトグラフィーは、} FPLCを使用してタンパク質を精製するために一般的に使用されます。

サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC) またはゲル濾過クロマトグラフィーとも呼ばれ、分子をサイズ (より正確には流体力学的直径または流体力学的容積) に応じて分離します。より小さな分子は媒体の細孔に入ることができるため、分子は捕捉され、移動相の流れから除去されます。細孔内の平均滞留時間は、分析対象分子の有効サイズによって異なります。ただし、充填剤の平均細孔サイズより大きい分子は排除されるため、実質的に保持されません。このような分子は最初に溶出されます。これは通常、低解像度のクロマトグラフィー技術であるため、精製の最後の「仕上げ」ステップで使用されることがよくあります。また、精製されたタンパク質の三次構造および四次構造を決定するのにも役立ちます。特に、ネイティブ溶液条件下で実行できるためです。

生化学分離プロセス用の拡張ベッドクロマトグラフィー吸着（EBA）カラムは、拡張ベッドの底部の多孔質ブロッキングふるい板の下に位置する自己洗浄機能を有する圧力均等化液体分配器と、拡張ベッドの上部に位置するバックフラッシュ洗浄機能を有する上部ノズルアセンブリと、拡張ベッドに添加される原料液のより良い分配によって、拡張ベッド層を通過する流体がピストンフローの状態を示すことを保証する。拡張ベッド層はピストンフローの状態を示す。拡張ベッドクロマトグラフィー分離カラムは、拡張ベッドの分離効率を高めるという利点を有する。

拡張床吸着 (EBA) クロマトグラフィーは、精製されていない粗サンプルから直接タンパク質を捕捉する便利で効果的な技術です。EBA クロマトグラフィーでは、まず平衡化バッファーの上向きの流れによって沈殿床が拡張されます。次に、可溶性タンパク質、汚染物質、細胞、細胞破片の混合物である粗原料が、拡張床を上向きに通過します。標的タンパク質は吸着剤に捕捉され、微粒子と汚染物質は通過します。上向きの流れを維持しながら溶出バッファーを変更すると、拡張床モードで標的タンパク質が脱着されます。または、流れを逆にすると、吸着された粒子はすぐに沈殿し、タンパク質は溶出バッファーによって脱着できます。溶出に使用するモード (拡張床または沈殿床) は、原料の特性によって異なります。溶出後、吸着剤は定義済みの定置洗浄 (CIP) 溶液で洗浄され、洗浄後にカラム再生 (さらに使用するために) または保管が行われます。

逆相クロマトグラフィー (RPC) は、移動相の極性が固定相より大幅に高い液体クロマトグラフィー手順です。この名前は、通常相液体クロマトグラフィーでは移動相の極性が固定相より大幅に低いことに由来しています。移動相中の疎水性分子は、比較的疎水性の固定相に吸着する傾向があります。移動相中の親水性分子は、最初に溶出する傾向があります。分離カラムは、通常、シリカ粒子基質に結合した C8 または C18 炭素鎖で構成されています。

疎水性相互作用クロマトグラフィー (HIC) は、タンパク質などの分析対象物を、その分析対象物とクロマトグラフィー マトリックス間の疎水性相互作用に基づいて分離する精製および分析技術です。この技術は、逆相分離に対する非変性直交アプローチを提供し、天然構造と潜在的にタンパク質の活性を維持します。疎水性相互作用クロマトグラフィーでは、マトリックス材料が疎水性基でわずかに置換されます。これらの基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、オクチル、またはフェニル基の範囲です。^[27]塩濃度が高い場合、タンパク質表面の非極性側鎖が疎水性基と「相互作用」します。つまり、両方のタイプの基が極性溶媒によって排除されます (疎水性効果はイオン強度の増加によって増強されます)。したがって、サンプルは極性の高いバッファー内のカラムに適用され、これにより分析対象物上の疎水性パッチが固定相と結合します。溶出液は通常、塩濃度を下げたり、洗剤濃度を上げたり（疎水性相互作用を阻害する）、pH を変えたりした水性緩衝液です。使用する塩の種類は極めて重要で、ホフマイスター系列で定義されるよりコスモトロピックな塩は、分子の周囲に最も多くの水構造を形成し、結果として疎水圧をもたらします。この目的では硫酸アンモニウムがよく使用されます。有機溶媒または極性の低い他の成分を追加すると、分解能が向上する場合があります。

一般的に、サンプルがpHの変化や他のタイプのクロマトグラフィーで一般的に使用される強力な溶媒に敏感だが、高塩濃度には敏感でない場合、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）が有利です。一般的に、緩衝液中の塩の量が変化します。2012年に、MüllerとFranzrebは、4つの異なるタイプの疎水性樹脂とウシ血清アルブミン（BSA）を使用して、温度がHICに及ぼす影響について説明しました。この研究では、マトリックスへのBSAの結合親和性に影響を与えるように温度を変えました。40℃から10℃までのサイクル温度は、マトリックスからすべてのBSAを効果的に洗い流すには不十分ですが、カラムが数回しか使用されない場合は非常に効果的であるという結論に達しました。^[28]温度を使用して変化を起こすことで、研究室は塩の購入コストを削減し、お金を節約できます。

高い塩濃度と温度変動を避けたい場合は、サンプルと競合して溶出するより疎水性の高いものを使うことができます。このいわゆる塩非依存型のHIC法は、血清からヒト免疫グロブリンG（IgG）を満足のいく収量で直接分離し、IgGをマトリックスから置換するための競合剤としてβ-シクロデキストリンを使用しました。^[29]塩濃度が高いとタンパク質が沈殿することが知られているため、塩に敏感なサンプルでHICを使用する可能性が大きく広がりました。

流体力学クロマトグラフィー（HDC）は、大きな液滴が小さな液滴よりも速く移動するという観察された現象に由来しています。^[30]カラム内でこれが起こるのは、大きな液滴の質量中心が、小さな液滴の全体的なサイズが大きいために、カラムの側面に近づくことができないためです。^[31]大きな液滴は最初にカラムの中央から溶出するのに対し、小さな液滴はカラムの側面に付着して最後に溶出します。この形式のクロマトグラフィーは、光散乱検出器、粘度計、屈折計と組み合わせて使用​​すると、モル質量（または分子量）、サイズ、形状、構造によって分析対象物を分離するのに役立ちます。^{[32] HDCには、主にオープンチューブと}パックドカラムの2種類があります。オープンチューブは小さな粒子の分離時間が短いのに対し、パックドカラムHDCは分解能を高めることができ、平均分子量がダルトンよりも大きい粒子に適しています。^[33] HDCは他のタイプのクロマトグラフィーとは異なり、充填カラム内の粒子の周囲と粒子間の空間でのみ分離が行われる。^[34]${\displaystyle 10^{5}}$

HDC はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と同じ溶出順序を共有していますが、2 つのプロセスは多くの点で異なります。 ^[33] 2 種類の分離を比較した研究で、Isenberg、Brewer、Côté、および Striegel は多糖類の特性評価に両方の方法を使用し、多角光散乱(MALS)と組み合わせた HDC は、オフライン MALS と比較して、SEC よりも大幅に短い時間でより正確なモル質量分布を達成すると結論付けています。 ^[35]これは主に、分離中にカラムの細孔が分析対象物を分解し、質量分布に影響を与える傾向があるため、SEC がより破壊的な手法であるためです。^[35]ただし、HDC の主な欠点は分析対象物のピークの分解能が低いことです。そのため、分解されにくい化学物質や迅速な溶出が重要でない化学物質を使用する場合は、SEC の方が実行可能なオプションになります。^[36]

HDC は、マイクロ流体工学 の分野で特に重要な役割を果たしています。HDC オンチップ システムの最初の成功した装置は、2002 年に Chmela らによって提案されました。^[37]彼らの設計では、直径 26～110 nm の粒子について、長さ 80 mm のチャネルを使用して 3 分間のタイムスケールで分離を達成できましたが、著者らは保持および分散パラメータを改善する必要があると述べました。^[37] Jellema、Markesteijn、Westerweel、および Verpoorte による 2010 年の出版物では、双方向の再循環フローで HDC を実装すると、長さ 3 mm のチャネルのみで高解像度のサイズベースの分離が得られました。^[38]以前の研究では長さ 80 mm のチャネルが使用されていたことを考慮すると、このように短いチャネルで高解像度を実現できたことは特に印象的でした。^[37]は、HDCと重力に基づいたマイクロ流体選別装置を提案した。これは、超音波で造影剤を注入する際に、直径が6ミクロンを超える潜在的に危険な粒子が血流に入るのを防ぐのに役立った。^[39]この研究はまた、重力ベースの装置を使用する利点として、流れを駆動する外部電子機器がないため、マイクロ流体の環境持続可能性の進歩をもたらした。

場合によっては、1つのカラムを使用することで得られる選択性は、複雑なサンプル中の分析対象物の分解能を提供するのに不十分な場合があります。2次元クロマトグラフィーは、異なる物理化学的（化学分類）特性を持つ2番目のカラムを使用して、これらのピークの分解能を高めることを目的としています。^{[40] [41]}この新しい固体支持体上の保持メカニズムは1次元目の分離とは異なるため、1次元クロマトグラフィーでは区別できない化合物を2次元クロマトグラフィーで分離することが可能です。さらに、2次元目の分離は1次元目よりも速く起こります。 ^[40] TDC分離の例としては、サンプルを正方形のプレートの1つの角にスポットし、展開、風乾した後、90°回転させ、通常は2番目の溶媒システムで再展開する方法があります。

二次元クロマトグラフィーはGCまたはLC分離に適用できます。^{[40] [41]}ハートカットアプローチでは、分離のために第一次元上の特定の関心領域を選択します。^[42]包括的アプローチでは、第二次元の分離ですべての分析対象物を使用します。^{[40] [41]}

擬似移動床 (SMB) 技術は、高性能液体クロマトグラフィーの一種で、他の方法では分離が困難または不可能な粒子や化合物を分離するために使用されます。この分離の向上は、固定相を無制限に長くするために使用されるバルブとカラムの配置によってもたらされます。分取クロマトグラフィーの移動床技術では、供給物の流入と分析物の回収は同時かつ連続的に行われますが、連続的に移動する床の実用上の困難さから、擬似移動床技術が提案されました。擬似移動床技術では、床を移動させる代わりに、サンプル入口と分析物の出口の位置が連続的に移動され、移動床のような印象を与えます。真の移動床クロマトグラフィー (TMBC) は理論上の概念にすぎません。そのシミュレーションである SMBC は、直列に接続された多数のカラムと複雑なバルブ配置を使用して実現されます。このバルブ配置により、任意のカラムの適切な位置でサンプルと溶媒の供給、および分析物と廃棄物の取り出しが可能になり、一定の間隔でサンプルの入口を一方向に、溶媒の入口を反対方向に切り替えながら、分析物と廃棄物の取り出し位置も適切に変更できるようになります。

熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析法は、サンプルを加熱して分解し、小さな分子を生成し、それをガスクロマトグラフィーで分離して質量分析法で検出する化学分析法です。

熱分解は、不活性雰囲気または真空中での物質の熱分解です。サンプルは白金線に直接接触するか、石英サンプル管に入れられ、急速に 600～1000 °C に加熱されます。用途に応じて、さらに高い温度が使用されます。実際の熱分解装置では、等温炉、誘導加熱 (キュリー点フィラメント)、白金フィラメントを使用した抵抗加熱の 3 つの異なる加熱技術が使用されています。大きな分子は最も弱い部分で分解し、より小さく揮発性の高い断片を生成します。これらの断片は、ガスクロマトグラフィーで分離できます。熱分解 GC クロマトグラムは、さまざまな分解生成物が形成されるため、通常は複雑です。データは、物質の同一性を証明するための指紋として使用することも、GC/MS データを使用して個々の断片を識別し、構造情報を取得するために使用することもできます。極性断片の揮発性を高めるために、熱分解前にさまざまなメチル化試薬をサンプルに追加できます。

専用の熱分解装置の使用に加えて、固体および液体サンプルの熱分解 GC は、急速加熱 (最大 30 °C/s) と 600～650 °C の高温を提供するプログラム可能温度気化装置 (PTV) インジェクター内で直接実行できます。これは、一部の熱分解アプリケーションには十分です。主な利点は、専用の機器を購入する必要がなく、日常的な GC 分析の一部として熱分解を実行できることです。この場合、石英 GC 入口ライナーを使用する必要があります。定量データを取得でき、PTV インジェクター内での誘導体化の良好な結果も公開されています。

高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC) は、タンパク質の混合物を分析または精製するためによく使用される液体クロマトグラフィーの一種です。他のクロマトグラフィーと同様に、混合物の異なる成分が 2 つの物質、つまり移動する液体 (「移動相」) と多孔質固体 (固定相) に対して異なる親和性を持つため、分離が可能です。FPLC では、移動相は水溶液、つまり「バッファー」です。バッファーの流量は容積移送ポンプによって制御され、通常は一定に保たれますが、バッファーの組成は、2 つ以上の外部リザーバーから異なる割合で液体を引き出すことによって変更できます。固定相は、通常は架橋アガロースからなるビーズで構成された樹脂で、円筒形のガラスまたはプラスチックのカラムに詰められています。FPLC 樹脂は、用途に応じて、さまざまなビーズ サイズと表面リガンドで利用できます。

向流クロマトグラフィー（CCC）は、液液クロマトグラフィーの一種であり、固定相と移動相の両方が液体であり、液体固定相は強い遠心力によって停滞状態に保たれます。^[43]

CCC 機器の動作原理には、ボビンに巻き付けられたオープン チューブで構成されるカラムが必要です。ボビンは 2 軸の旋回運動 (カーディオイド) で回転し、これにより、回転ごとに可変重力 (G) フィールドがカラムに作用します。この運動により、カラムは 1 回転ごとに 1 つの分割ステップを経験し、サンプルの成分は、使用されている 2 つの混和しない液体相間の分割係数によってカラム内で分離されます。現在、多くの種類の CCC が利用可能です。これには、HSCCC (高速 CCC) と HPCCC (高性能 CCC) が含まれます。HPCCC は、現在利用可能な機器の最新かつ最高のパフォーマンス バージョンです。

CPC (遠心分離クロマトグラフィーまたは静水向流クロマトグラフィー) 装置では、カラムは、ローターに取り付けられたダクトで相互接続された一連のセルで構成されています。このローターは中心軸を中心に回転し、固定相を所定の位置に保持するために必要な遠心場を作り出します。CPC の分離プロセスは、固定相と移動相の間の溶質の分配によってのみ制御され、このメカニズムは溶質の分配係数 ( K _D ) を使用して簡単に説明できます。CPC 装置は、約 10 ミリリットルから 10 リットルの容量のさまざまなサイズのカラムで、研究室、パイロット、および産業規模の分離用に市販されています。

向流クロマトグラフィー（上記参照）とは対照的に、周期的向流クロマトグラフィー（PCC）では、固体固定相と液体移動相のみを使用します。したがって、向流クロマトグラフィーよりも、従来のアフィニティークロマトグラフィーに非常に似ています。 PCC では複数のカラムを使用し、ローディング段階ではこれらのカラムが一列に接続されます。このモードでは、樹脂が完全に飽和する前にカラムを突破した生成物を失うことなく、このシリーズの最初のカラムにオーバーロードすることができます。突破した生成物は、後続のカラムで捕捉されます。次のステップでは、カラムが互いに切り離されます。最初のカラムは、他のカラムがまだロードされている間に洗浄および溶出されます。（最初は）最初のカラムが再平衡化されたら、ローディング ストリームに再導入されますが、最後のカラムとして導入されます。その後、プロセスは循環的に続行されます。

キラルクロマトグラフィーでは、立体異性体の分離が行われます。エナンチオマーの場合、3 次元の鏡像であること以外には化学的または物理的な違いはありません。キラル分離を行うには、移動相または固定相のいずれかをキラルにして、分析対象物間に異なる親和性を与える必要があります。キラルクロマトグラフィー HPLC カラム(キラル固定相付き) は、順相と逆相の両方で市販されています。

従来のクロマトグラフィーでは、ラセミ体のエナンチオマー混合物を分離することはできない。しかし、場合によっては、非ラセミ体のエナンチオマー混合物が、従来の液体クロマトグラフィー（例えば、キラル移動相または固定相を使用しないHPLC）によって予期せず分離されることがある。^{[44] [45]}

水性通常相（ANP）クロマトグラフィーは、水が移動相溶媒システムの成分の1つである古典的な通常相モード（すなわち、移動相が固定相よりも著しく極性が低い）の溶出挙動を特徴とする。保持メカニズムが分配ではなく吸着によるものである点で、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）と区別される。^[46]

クロマトグラフィーは、製薬業界、食品・飲料業界、化学業界、法医学、環境 分析、病院など多くの分野で使用されています。^[47]

• クロマトグラフィーのIUPAC命名法
• オーバーラップピークスプログラム – シミュレーションによる学習
• クロマトグラフィー ビデオ – MIT OCW – デジタル ラボ テクニック マニュアル
• クロマトグラフィー方程式計算機 – MicroSolv Technology Corporation