高速タンパク質液体クロマトグラフィー

高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC ）は、タンパク質の混合物を分析または精製するためによく使用される液体クロマトグラフィーの一種です。他のクロマトグラフィーと同様に、混合物の異なる成分が、移動流体（移動相）と多孔質固体（固定相）という 2 つの材料に対して異なる親和性を持つため、分離が可能です。FPLC では、移動相は水性緩衝溶液です。^{[ 1 ]}緩衝液の流量は容積式ポンプによって制御され、通常は一定に保たれますが、緩衝液の組成は、2 つ以上の外部リザーバーから異なる割合で流体を吸引することによって変更できます。固定相は、通常、架橋アガロースからなるビーズで構成され、円筒形のガラスまたはプラスチックカラムに充填された樹脂です。FPLC 樹脂は、用途に応じて、さまざまなビーズサイズと表面リガンドで入手できます。

FPLCは1982年にスウェーデンのPharmacia社によって開発・販売され^{[ 2 ]}、当初は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と対比して高速液体クロマトグラフィーと呼ばれていました。FPLCは一般的にタンパク質にのみ適用されますが、樹脂や緩衝液の選択肢が豊富なため、幅広い用途があります。HPLCとは対照的に、使用される緩衝液の圧力は比較的低く、通常5 bar未満ですが、流量は比較的高く、通常1～5 ml/分です。

FPLCは、総容量5 ml以下のカラムでミリグラムの混合物を分析することから、数リットルの容量のカラムでキログラムの精製タンパク質を工業的に生産することまで、容易にスケールアップできます。混合物の分析に使用する場合、溶出液は通常1～5 mlの分画で収集され、さらに分析できます。タンパク質の精製に使用する場合、収集容器は2つだけで済みます。1つは精製された製品用、もう1つは廃棄物用です。^{[ 3 ]}

一般的な FPLC 戦略では、目的のタンパク質がバッファー A (ランニング バッファー) 中では電荷相互作用によって結合し、バッファー B (溶出バッファー) 中では解離して溶液に戻る樹脂が選択されます。1 つ以上の目的のタンパク質を含む混合物を 100% バッファー A に溶解し、カラムに送り込みます。目的のタンパク質は樹脂に結合し、他の成分はバッファー中を移動します。^{[ 4 ]}バッファーの総流量は一定に保たれますが、バッファー B (「溶出」バッファー) の割合は、プログラムされた濃度変化 (「グラジエント」) に従って 0% から 100% まで徐々に増加します。このプロセスのどこかの時点で、結合した各タンパク質が解離して溶出液中に現れます。溶出液は、塩濃度 (導電率による) とタンパク質濃度 (波長 280 nmの紫外線の吸収による) を測定する 2 つの検出器を通過します。 各タンパク質が溶出されると、溶出液中にタンパク質濃度の「ピーク」として現れ、それを回収してさらに使用することができます。^{[ 5 ]}

一般的な実験室用FPLCは、1台または2台の高精度ポンプ、制御ユニット、カラム、検出システム、および分画コレクターで構成されています。システムを手動で操作することも可能ですが、通常は各コンポーネントがパーソナルコンピュータ、または旧型の装置ではマイクロコントローラに接続されています。

FPLCで使用されるカラムは、固定相として小さな（マイクロメートルスケールの）粒子またはゲルビーズを含む、大きな（内径がミリメートルオーダーの）チューブです。^{[ 6 ]}クロマトグラフィーベッドはカラム内部のゲルビーズで構成されており、サンプルはインジェクターに導入され、流れる溶媒によってカラムに運ばれます。さまざまな成分がゲルに付着したり、ゲルを通して拡散したりすることによって、サンプル混合物が分離されます。

FPLCで使用されるカラムは、サイズ（サイズ排除クロマトグラフィー）、電荷分布（イオン交換）、疎水性、逆相、または生体認識（アフィニティークロマトグラフィーと同様）に基づいて高分子を分離できます。^{[ 7 ]}使いやすさを考慮して、イオン交換、ゲルろ過（サイズ排除）、疎水性相互作用、アフィニティークロマトグラフィーなどの技術用の幅広いプレパックカラムが利用可能です。^{[ 8 ]} FPLCは、FPLCで使用されるカラムが最大圧力3～4 MPa（435～580 psi）までしか使用できない点でHPLCとは異なります。したがって、HPLCの圧力を制限できる場合は、各FPLCカラムをHPLC装置でも使用できます。

クロマトグラフィー法を組み合わせることで、目的分子を精製することができます。FPLCを用いてタンパク質を精製する目的は、目的分子を十分な純度で、かつ生物学的に活性な状態で得ることです。最終製品の品質は、出発物質の種類と量、分離効率、精製樹脂の選択性によって異なります。特定の精製プロトコルの最終目標は、目的分子の収量と純度を、許容できる結果が得られるよう、最も迅速、安価、かつ安全な方法で得ることです。必要な純度の範囲は、基本的な分析（例えばSDS-PAGEやELISA）に必要な、不純物のみを除去する純度から、構造解析（NMRやX線結晶構造解析）に必要な、目的分子が99%以上含まれる純度まで様々です。必要な純度とは、目的分子の生物学的活性が保持される純度を意味する場合もあります。これらの要求に基づいて、実験目標を達成するために必要な出発物質の量を決定することができます。出発原料が限られており、精製プロトコルの完全な最適化ができない場合は、最小限の調整と最適化手順で済む安全な標準プロトコルが求められます。これは実験時間、収量、経済性の観点からは最適ではないかもしれませんが、実験目標は達成できます。一方、出発原料が十分にあるため、より完全なプロトコルを開発できる場合は、分離目標を達成するために必要な作業量は、利用可能なサンプル情報と標的分子の特性によって異なります。精製プロトコルの開発における制約は、多くの場合、精製対象物質の供給源に依存します。天然由来（例えば、採取した組織や生物）、組換え由来（例えば、原核生物または真核生物のベクターをそれぞれの発現系で使用する場合）、あるいは完全に合成由来のいずれであるかによって決まります。

クロマトグラフィー法では活性物質の収率を100%にすることは不可能であり、全体の収率は精製手順のステップ数に依存します。各ステップを目的に合わせて最適化し、ステップ間の処理を最小限に抑えるように配置することで、ステップ数を最小限に抑えることができます。

一般的な多段階精製プロトコルは、イオン交換クロマトグラフィー（IEC）を利用することが多い予備的な捕捉ステップから始まります。媒体（固定相）樹脂はビーズで構成されており、そのサイズは大きいもの（高速流速に適しており、分解能を犠牲にしてサンプルの清澄化はほとんどまたは全く行われない）から小さいもの（他のすべての条件が同じであれば、可能な限り最高の分解能が得られる）まで様々です。短くて幅の広いカラム形状は、カラム上でのサンプルの横方向拡散のため、分解能を犠牲にして高速流速に適しています。サイズ排除クロマトグラフィーなどの技術が有用であるためには、非常に長く細いカラムと最小限のサンプル量（カラム容量の最大5%）が必要です。疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）も、最初のステップおよび/または中間ステップに使用できます。HICの選択性は、ランニングpHに依存せず、塩濃度勾配を下げて使用します。HICでは、コンディショニングとして、バッファーAの濃度に合わせるためにサンプルに硫酸アンモニウムを添加します。 HICをIECの前に使用する場合、 IECステップのバッファーAのイオン強度に合わせるために、希釈、透析、またはゲルろ過によるバッファー交換によってイオン強度を下げる必要があります。そのため、通常はHICの前にIECを実施します。これは、IECの高塩溶出条件が、次の精製ステップでHIC樹脂に結合するのに理想的であるためです。精製は、必要な最終レベルの精製を達成するために使用され、一般的にゲルろ過カラムで行われます。純度を向上させるために、追加の中間精製ステップを追加したり、さまざまなステップを最適化したりすることができます。この追加ステップには通常、まったく異なる条件下でのもう1回のIECが含まれます。

これはタンパク質の一般的な精製プロトコルの例ですが、最終目標を達成するために使用されるバッファー条件、流速、および樹脂は、幅広いターゲットタンパク質をカバーするように選択できます。すべてのタンパク質は異なる挙動を示し、予測から逸脱することが多いため、このような柔軟性は機能的な精製システムにとって不可欠です。^{[ 9 ]}

• FPLCリスク評価の例（リーパー・グループ、ケンブリッジ大学）