ゲノムライブラリ

ゲノムライブラリは、単一の生物の全ゲノムDNAを構成する重複した DNA 断片の集合です。DNA は、それぞれが異なるDNA挿入物を含む同一のベクターの集団に格納されます。ゲノムライブラリを構築するには、生物の DNA を細胞から抽出し、制限酵素で消化してDNA を特定のサイズの断片に切断します。次に、断片をDNA リガーゼを使用してベクターに挿入します。^{[1]次に、ベクター DNA を宿主生物 (通常は}大腸菌または酵母の集団) に取り込ませます。各細胞にはベクター分子が 1 つだけ含まれています。ベクターを運ぶ宿主細胞を使用すると、ライブラリから特定のクローンを簡単に増幅して取得し、分析することができます。^[2]

ベクターにはさまざまな種類があり、挿入容量もさまざまです。一般的に、ゲノムが大きい生物から作られたライブラリには、より大きな挿入物を備えたベクターが必要であり、そのためライブラリを作成するのに必要なベクター分子は少なくなります。研究者は、完全なゲノムカバレッジに必要なクローンの数を見つけるために、理想的な挿入サイズも考慮してベクターを選択できます。^[3]

ゲノムライブラリは、シーケンシングアプリケーションによく使用され、ヒトゲノムやいくつかのモデル生物を含むいくつかの生物の全ゲノムシーケンシングにおいて重要な役割を果たしてきました。^{[4] [5]}

史上初の DNA ベースのゲノムの完全配列決定は、1977 年に 2 度のノーベル賞受賞者であるフレデリック サンガーによって達成されました。サンガーと彼の科学者チームは、 DNA配列決定に使用するバクテリオファージphi X 174のライブラリを作成しました。^{[6]この成功の重要性により、}遺伝子治療の研究のためにゲノムの配列決定に対する需要がますます高まっています。現在、チームはゲノム内の多型をカタログ化し、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、関節リウマチ、1 型糖尿病などの疾患に寄与する候補遺伝子を調査できます。^{[7]これらは、ゲノム ライブラリを作成して配列決定する能力による}ゲノムワイド関連研究の進歩によるものです。以前は、連鎖研究と候補遺伝子研究が唯一のアプローチの一部でした。^[8]

ゲノムライブラリの構築には、多くの組み換え DNA分子の作成が含まれます。生物のゲノムDNAを抽出し、制限酵素で消化します。非常に小さなゲノム(~10 kb)を持つ生物の場合、消化された断片はゲル電気泳動で分離できます。分離された断片は切り取って、個別にベクターにクローニングできます。ただし、大きなゲノムを制限酵素で消化すると、個別に切り取るには断片が多すぎます。断片のセット全体をベクターと一緒にクローニングする必要があり、クローンの分離は後で行うことができます。どちらの場合も、断片は同じ制限酵素で消化されたベクターに連結されます。挿入されたゲノム DNA 断片を含むベクターは、宿主生物に導入できます。^[1]

以下は、大規模なゲノムからゲノムライブラリを作成する手順です。

1. DNAを抽出し、精製します。
2. 制限酵素で DNA を消化します。これにより、それぞれ 1 つ以上の遺伝子を含む、サイズが類似した断片が作成されます。
3. 同じ制限酵素で切断されたベクターに DNA 断片を挿入します。DNA リガーゼ酵素を使用して DNA 断片をベクターに封じ込めます。これにより、組み換え分子の大きなプールが作成されます。
4. これらの組み換え分子は形質転換によって宿主細菌に取り込まれ、DNAライブラリが作成される。^{[9] [10]}

以下に、上記で概説した手順を図で示します。

ラムダファージなどのウイルスベクターを使用してゲノムライブラリを構築した後、ライブラリの力価を決定できます。力価を計算することで、研究者はライブラリで正常に作成された感染性ウイルス粒子の数を概算できます。これを行うには、ライブラリの希釈液を使用して、既知の濃度の大腸菌の培養物を形質転換します 。次に、培養物を寒天プレートに塗布し、一晩インキュベートします。ウイルスプラークの数を数え、ライブラリ内の感染性ウイルス粒子の総数を計算するために使用できます。ほとんどのウイルスベクターには、インサートを含むクローンとインサートを持たないクローンを区別できるマーカーも付いています。これにより、研究者は、ライブラリのフラグメントを実際に運ぶ感染性ウイルス粒子の割合も決定できます。^[11]

同様の方法を使用して、プラスミドやBACなどの非ウイルスベクターで作成されたゲノムライブラリの力価を測定することができます。ライブラリのテストライゲーションを使用して、大腸菌を形質転換できます。次に、形質転換物を寒天プレートに広げ、一晩培養します。形質転換の力価は、プレートに存在するコロニーの数を数えることによって決定されます。これらのベクターには通常、挿入物を含むクローンと挿入物を含まないクローンを区別できる選択マーカーがあります。このテストを行うことで、研究者はライゲーションの効率を判断し、必要に応じて調整して、ライブラリに必要な数のクローンを確実に取得することができます。^[12]

ライブラリから目的の領域を含むクローンを分離するためには、まずライブラリをスクリーニングする必要があります。スクリーニングの1つの方法はハイブリダイゼーションです。ライブラリの各形質転換宿主細胞には、DNAの挿入部が1つだけ含まれます。ライブラリ全体を培地上のフィルター上に播種することができます。フィルターとコロニーはハイブリダイゼーション用に準備され、プローブで標識されます。^{[13]標的DNA（目的の挿入部）は、以下に示すようにプローブとのハイ}ブリダイゼーションにより、オートラジオグラフィーなどの検出によって識別できます。

スクリーニングの別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する方法です。一部のライブラリはクローンのプールとして保存されており、PCRによるスクリーニングは特定のクローンを含むプールを識別する効率的な方法です。^[2]

ゲノムサイズは生物によって異なるため、それに応じてクローニングベクターを選択する必要があります。ゲノムが大きい場合は、比較的少数のクローンでゲノム全体をカバーできるように、大容量のベクターを選択する必要があります。ただし、大容量のベクターに含まれるインサートの特性評価は、多くの場合より困難です。 ^[3]

以下は、ゲノムライブラリに一般的に使用されるいくつかの種類のベクターと、それぞれが通常保持する挿入サイズを示す表です。

プラスミドは、分子クローニングによく使用される二本鎖の環状DNA分子です。プラスミドの長さは通常 2 ～ 4 キロベースペア (kb) で、最大 15kb の挿入物を運ぶことができます。プラスミドには複製起点が含まれており、宿主染色体とは独立して細菌内で複製することができます。プラスミドには一般に抗生物質耐性遺伝子が含まれており、プラスミドを含む細菌細胞を選択できます。多くのプラスミドにはレポーター遺伝子も含まれており、研究者は挿入物を含むクローンと挿入物を含まないクローンを区別できます。^[3]

λファージは大腸菌に感染する二本鎖DNAウイルスです。λ染色体は48.5kbの長さで、最大25kbの挿入物を運ぶことができます。これらの挿入物はλ染色体の非必須ウイルス配列を置き換えますが、ウイルス粒子の形成と感染に必要な遺伝子はそのまま残ります。挿入DNAはウイルスDNAとともに複製され、一緒にウイルス粒子にパッケージ化されます。これらの粒子は感染と増殖に非常に効率的であり、組み換えλ染色体の生産量が増加します。^[3]ただし、挿入サイズが小さいため、λファージで作成されたライブラリでは、ゲノム全体をカバーするために多くのクローンが必要になる場合があります。^[14]

コスミドベクターは、コスミド配列と呼ばれるバクテリオファージλ DNAの小さな領域を含むプラスミドです。この配列により、コスミドをバクテリオファージλ粒子にパッケージ化することができます。線状コスミドを含むこれらの粒子は、形質導入によって宿主細胞に導入されます。宿主内に入ると、コスミドは宿主のDNAリガーゼの助けを借りて環状になり、プラスミドとして機能します。コスミドは最大40kbのサイズの挿入物を運ぶことができます。^[2]

バクテリオファージ P1ベクターは、70～100kb のサイズの挿入物を保持できます。これらは、バクテリオファージ P1 粒子にパッケージ化された線状 DNA 分子として始まります。これらの粒子は、Cre リコンビナーゼを発現する大腸菌株に注入されます。線状 P1 ベクターは、ベクター内の 2 つの loxP サイト間の組換えによって環状になります。P1 ベクターには通常、抗生物質耐性遺伝子と、挿入物を含むクローンとそうでないクローンを区別するための陽性選択マーカーが含まれています。P1 ベクターには、P1 プラスミドレプリコンも含まれており、これにより、細胞内にベクターのコピーが 1 つだけ存在するようになります。ただし、誘導性プロモーターによって制御される 2 つ目の P1 レプリ​​コン (P1 溶解性レプリコンと呼ばれる) があります。このプロモーターにより、 DNA 抽出前に細胞ごとにベクターのコピーを複数増幅できます。^[2]

P1人工染色体（PAC）は、P1ベクターと細菌人工染色体（BAC）の両方の特徴を備えています。P1ベクターと同様に、上記のようにプラスミドと溶解性レプリコンが含まれています。P1ベクターとは異なり、形質導入のためにバクテリオファージ粒子にパッケージ化する必要はありません。代わりに、BACと同様に、エレクトロポレーションによって環状DNA分子として大腸菌に導入されます。 ^[2]また、BACと同様に、複製起点が1つであるため、準備が比較的困難です。^[14]

細菌人工染色体（BAC）は、通常約7kbの長さの環状DNA分子で、最大300kbのサイズの挿入物を保持できます。BACベクターには、大腸菌F因子由来のレプリコンが含まれており、これにより、細胞あたり1つのコピーが維持されます。^[4]挿入物がBACに連結されると、BACはエレクトロポレーションによって大腸菌の組換え欠損株に導入されます。ほとんどのBACベクターには、抗生物質耐性遺伝子と陽性選択マーカーが含まれています。 ^[2]右の図は、BACベクターが制限酵素で切断され、その後、リガーゼによって再アニールされる外来DNAが挿入されていることを示しています。全体として、これは非常に安定したベクターですが、PACと同様に複製起点が1つであるため、準備が難しい場合があります。^[14]

酵母人工染色体(YAC) は、テロメア、セントロメア、複製起点など、本物の酵母染色体に必要な特徴を備えた線状 DNA 分子です。YAC の中央に大きな DNA インサートを連結して、インサートの両側に YAC の「アーム」を配置することができます。組み換え YAC は形質転換によって酵母に導入されます。YACに含まれる選択マーカーによって、形質転換に成功した細胞を識別できます。YAC は最大 2000kb のインサートを保持できますが、ほとんどの YAC ライブラリには 250～400kb のサイズのインサートが含まれています。理論的には、YAC が保持できるインサートのサイズに上限はありません。インサートに使用する DNA の調製の品質によって、サイズ制限が決まります。^{[2] YAC を使用する上で最も難しい点は、}再配列が起こりやすいことです。^[14]

ベクターの選択では、作成されたライブラリがゲノム全体を代表するものであることを確認する必要があります。制限酵素から誘導されたゲノムの挿入物は、他の挿入物と比較して、ライブラリ内に存在する可能性が等しくなければなりません。さらに、組み換え分子には、ライブラリのサイズが適切に処理できるように十分な大きさの挿入物が含まれている必要があります。 ^[14]これは、特にライブラリに必要なクローンの数によって決まります。すべての遺伝子のサンプルを取得するためのクローンの数は、生物のゲノムのサイズと平均挿入サイズによって決まります。これは、次の式（Carbon and Clarke 式とも呼ばれる）で表されます。^[15]

${\displaystyle N={\frac {ln(1-P)}{ln(1-f)}}}$

どこ、

${\displaystyle N}$組換え体の必要数である^[16]

${\displaystyle P}$ゲノム内の任意の断片が、作成されたライブラリ内で少なくとも1回出現する望ましい確率である。

${\displaystyle f}$単一の組み換え体におけるゲノムの割合である

${\displaystyle f}$さらに次のように示せます:

${\displaystyle f={\frac {i}{g}}}$

どこ、

${\displaystyle i}$インサートサイズは

${\displaystyle g}$ゲノムサイズは

したがって、インサートサイズを大きくすると（ベクターの選択によって）、ゲノムを表現するために必要なクローンの数が少なくなります。インサートサイズとゲノムサイズの比率は、1つのクローン内のそれぞれのゲノムの割合を表します。^[14]すべての部分を考慮した式は次のとおりです。

${\displaystyle N={\frac {ln(1-P)}{ln(1-{\frac {i}{g}})}}}$

上記の式は、挿入サイズが 2 万塩基対のベクター (ファージ ラムダ ベクターなど) を使用してゲノム内のすべての配列が表現されるという 99% の信頼度を決定するために使用できます。この例では、生物のゲノム サイズは 30 億塩基対です。

${\displaystyle N={\frac {ln(1-0.99)}{ln[1-{\frac {2.0\times 10^{4}basepairs}{3.0\times 10^{9}basepairs}}]}}}$

${\displaystyle N={\frac {-4.61}{-6.7\times 10^{-6}}}}$

${\displaystyle N=688,060}$クローン

したがって、この 30 億塩基対のゲノムからの特定の DNA 配列が、挿入サイズが 2 万塩基対のベクターを使用するライブラリ内に存在する確率を 99% にするには、約 688,060 個のクローンが必要になります。

ライブラリが作成されると、生物のゲノムを配列決定して、遺伝子が生物にどのように影響するかを解明したり、類似の生物をゲノムレベルで比較したりすることができます。前述のゲノムワイド関連研究では、多くの機能的形質に由来する候補遺伝子を特定できます。遺伝子はゲノムライブラリから分離され、ヒト細胞株または動物モデルで使用されてさらなる研究を行うことができます。^{[17]さらに、正確なゲノム表現と安定性の問題のない高忠実度のクローンを作成することは、}ショットガンシーケンシングまたは機能分析における完全な遺伝子の研究の中間体として大いに貢献します。 ^[10]

ゲノムライブラリの主な用途の1つは、階層的ショットガンシーケンシングです。これは、トップダウン、マップベース、またはクローンバイクローンシーケンシングとも呼ばれます。この戦略は、シーケンシングのハイスループット技術が利用可能になる前の1980年代に、ゲノム全体のシーケンシング用に開発されました。ゲノムライブラリの個々のクローンは、通常500bpから1000bpのより小さな断片に切り分けられ、シーケンシングがより扱いやすくなります。^[4]ゲノムライブラリのクローンがシーケンシングされると、その配列を使用して、シーケンシングされたクローンと重複する挿入を含む他のクローンをライブラリからスクリーニングできます。次に、重複する新しいクローンをシーケンシングしてコンティグを形成します。染色体ウォーキングと呼ばれるこの技術は、染色体全体のシーケンシングに利用できます。^[2]

全ゲノムショットガンシーケンシングは、大容量ベクターのライブラリを必要としないゲノムシーケンシングの別の方法です。代わりに、コンピュータアルゴリズムを使用して、ゲノム全体をカバーするために短いシーケンスリードを組み立てます。このため、ゲノムライブラリは、全ゲノムショットガンシーケンシングと組み合わせて使用​​されることがよくあります。ゲノムライブラリ内のいくつかのクローンからのインサートの両端をシーケンシングすることで、高解像度のマップを作成できます。このマップは、既知の距離の離れたシーケンスを提供し、ショットガンシーケンシングで取得したシーケンスリードのアセンブリに役立てることができます。^[4] 2003年に完了が宣言されたヒトゲノム配列は、BACライブラリとショットガンシーケンシングの両方を使用して組み立てられました。^{[18] [19]}

ゲノムワイド関連研究は、人類内の特定の遺伝子ターゲットと多型を見つけるための一般的なアプリケーションです。実際、国際ハップマッププロジェクトは、このデータをカタログ化して利用するために、複数の国の科学者と機関のパートナーシップを通じて作成されました。^[20]このプロジェクトの目標は、さまざまな個人の遺伝子配列を比較して、染色体領域内の類似点と相違点を明らかにすることです。^[20]参加国すべての科学者は、アフリカ、アジア、ヨーロッパの祖先の集団のデータを使用してこれらの属性をカタログ化しています。このようなゲノムワイド評価は、さらなる診断と薬物療法につながる可能性があり、将来のチームが遺伝的特徴を念頭に置いて治療法を調整することに焦点を当てるのに役立ちます。これらの概念はすでに遺伝子工学で活用されています。^[20]たとえば、研究チームは実際に、ヒトゲノムの2倍のカバレッジを表すライブラリを作成するPACシャトルベクターを構築しました。^[17]これは、病気を引き起こす遺伝子または遺伝子セットを特定するための素晴らしいリソースとして機能する可能性があります。さらに、これらの研究は、バキュロウイルスの研究で見られるように、転写調節を調査するための強力な方法として役立ちます。^[21]全体として、ゲノムライブラリの構築とDNA配列決定の進歩により、さまざまな分子標的を効率的に発見できるようになりました。^[5]このような効率的な方法によるこれらの特徴の同化は、新しい薬剤候補の採用を早めることができます。

クルーグ、カミングス、スペンサー、パラディーノ (2010)。遺伝学の基礎。ピアソン。pp. 355–264。ISBN 978-0-321-61869-6。{{cite book}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)

• ゲノムBACライブラリの構築