コスミド

コスミドは、ラムダファージのcos配列を含むハイブリッドプラスミドの一種である。^[1]遺伝子工学のクローニングベクターとしてよく使用されるコスミドは、ゲノムライブラリの構築にも使用できる。コスミドは、1978 年に Collins と Hohn によって初めて記述された。^[2] コスミドには、通常のバクテリオファージのパッケージサイズに基づいて制限される37～52 kb (通常は 45 kb) の DNA を含めることができる。コスミドは、適切な複製起点(ori) があればプラスミドとして複製できる。たとえば、哺乳類細胞ではSV40 ori 、二本鎖 DNA 複製ではColE1 ori、原核生物では一本鎖 DNA 複製ではf1 ori である。コスミドには抗生物質耐性などの選択遺伝子も含まれることが多く、抗生物質を含む培地に播種することで形質転換細胞を識別できる。コスミドを取り込まなかった細胞は増殖できない。^[3]

プラスミドとは異なり、コスミドは in vitro でファージ カプシドにパッケージングすることもできます。このステップでは、 cosサイトとしても知られる凝集末端が必要です。cos サイトは、ラムダファージをベクターとして使用したクローニングでも使用されますが、 cos配列を除いてほぼすべてのラムダ遺伝子が削除されています。その後、カプシド内のハイブリッドコスミド DNA は、形質導入によって細菌細胞に導入できます。cos サイト間に少なくとも 38 kb の DNA が必要となる in vitro パッケージングの要件があるため、挿入 DNA のないベクターはパッケージングされません (挿入された新しい DNA に多くの直接反復または回文 (逆方向反復) DNA が含まれている場合、プラスミドの不安定性が増大します。この不安定性は、DNA 組み換えに影響を与える特定の変異を持つ宿主細菌を使用することで大幅に打ち消すことができます (注: 逆方向反復がないことは、上記の最初の Hohn & Collins の出版物で指摘されています。^[4]も参照)。

Cos配列は長さが約 200 塩基対で、パッケージングに不可欠です。これらには、DNA が 12 bp 間隔でターミナーゼによって各鎖に切り込みを入れられるcosNサイトが含まれます。これにより、12 bp の 2 つの「粘着末端」または「粘着性末端」を持つ環状コスミドが直線化されます (DNA は、ファージ ヘッドに収まるように直線でなければなりません) 。cosB サイトは、鎖を切り込み、分離している間、ターミナーゼを保持します。次のコスミドの cosQ サイト (ローリング サークル複製は直線状のコンカテマーになることが多いため)は、前のコスミドがパッケージ化された後、細胞DNaseによる分解を防ぐためにターミナーゼによって保持されます。

コスミドは主に細菌のoriV 、抗生物質選択マーカーおよびクローニング部位を持つプラスミドですが、バクテリオファージラムダに由来する 1 つ、または最近では 2 つの cos 部位を持っています。実験の特定の目的に応じて、広域宿主コスミド、シャトルコスミド、または「哺乳類」コスミド (SV40 oriV および哺乳類選択マーカーにリンク) を利用できます。コスミドのローディング容量はベクター自体のサイズによって異なりますが、通常は約 40～45 kb です。クローニング手順では、2 つのベクターアームを生成し、これを外来 DNA に結合します。野生型コスミド DNA に対する選択は、サイズ排除によって簡単に行われます。そのため、コスミドは常にコロニーを形成し、プラークを形成しません。また、クローン密度ははるかに低く、連結された DNA 1 μg あたり約 10 ⁵～ 10 ⁶ CFUです。

組み換えラムダまたはコスミドライブラリの構築後、全 DNA はin vitro パッケージングと呼ばれる技術によって適切なE. coliホストに移されます。必要なパッケージング抽出物は、 E. coli cI857 溶原菌 (それぞれ red- gam- Sam および Dam (ヘッドアセンブリ) と Eam (テールアセンブリ)) から得られます。これらの抽出物は組み換え分子をin vitro で認識してパッケージ化し、成熟したファージ粒子 (ラムダベースのベクター) またはファージシェルに含まれる組み換えプラスミド (コスミド) を生成します。これらの違いは、ラムダ置換ベクターに有利な感染頻度の違いに反映されています。これにより、若干低いローディング容量が補われます。ファージライブラリは、コスミドライブラリよりも簡単に保存およびスクリーニングできます。

ターゲット DNA: クローン化されるゲノム DNA は、適切なサイズの範囲の制限断片に切断する必要があります。これは通常、部分的な制限に続いてサイズ分画または脱リン酸化 (子牛の腸ホスファターゼを使用) によって行われ、染色体のスクランブル、つまり物理的に連結されていない断片の連結を回避します。

よく使われるベクトルには「SuperCos 1」が含まれます