ゲートウェイテクノロジー

Gatewayクローニング法は、 1990 年代後半からInvitrogenが発明し商品化してきた分子クローニング法で、バクテリオファージ ラムダが細菌に感染する際に起こる組み込みおよび切除組み換え反応を利用します。この技術は、 Gateway att サイトと BP Clonase および LR Clonase と呼ばれる 2 つの独自の酵素ミックスを使用して、機能分析およびタンパク質発現のためにDNA 配列をマルチベクター システムに迅速かつ非常に効率的に移送する方法を提供します。in vivo では、これらの組み換え反応は、ラムダ/ファージ染色体 (attP) と細菌 (attB) の取り付け部位の組み換えによって促進されます。attP 部位と attB 部位間の組み換えの結果、ファージは 2 つの新しい組み換え部位 (attLeft および attRight) に挟まれた細菌ゲノムに組み込まれます。細菌染色体からのファージの除去と attP および attB 部位の再生は、どちらも特定の状況下での attL および attR 部位の再結合によって生じる可能性があります。

対象の DNA 配列は、これらの特別な Gateway Att サイトの修正バージョンに追加されます。BP Clonase と LR Clonase の 2 つの酵素反応が起こります。BP Clonase は、挿入物を囲む attB サイトとドナーベクターの attP サイトの間で起こります。この反応は BP Clonase 酵素混合物によって触媒され、attL ドメインに挟まれた対象の DNA を含むエントリークローンを生成します。反応の副産物として、致死性の ccdB 遺伝子がドナーベクターから切り出されます。LR Clonase は、生成されたエントリークローンの attL 領域とターゲットベクターの attR 領域の間で起こり、LR Clonase 酵素混合物によって触媒されます。その結果、attB 領域に挟まれた対象の DNA を含む発現クローンが生成されます。BP 反応と同様に、ccdB 遺伝子を含む DNA 配列がターゲットベクターから切り出されます。

ヒト、マウス、ラットの ORF (オープン リーディング フレーム)の大部分を含む Gateway Entry クローンの大規模なアーカイブは、 NIH (国立衛生研究所) の資金 (例: Mammalian Gene Collection、http://mgc.nci.nih.gov/ Archived 2015-02-25 at the Wayback Machine )を使用して研究コミュニティをサポートするために、ヒトcDNAライブラリからクローン化または化学的に合成されています。これらの遺伝子カセットは、標準的な Gateway クローニング プラスミドで利用できるため、研究者はこれらのカセットをプラスミドにすばやく移して遺伝子機能の分析を容易にすることができます。Gateway クローニングは、最初のセットアップに時間がかかり、従来の制限酵素やリガーゼ ベースのクローニング方法よりも高価ですが、時間を節約し、下流のアプリケーションでよりシンプルで非常に効率的なクローニングを提供します。

この技術は、生命科学研究コミュニティで広く採用されており、特に、何千もの DNA 断片を 1 種類のプラスミド (例: 哺乳類細胞でのタンパク質発現用の CMV プロモーターを含むプラスミド) に導入する必要がある場合や、1 つの DNA 断片を多くの異なる種類のプラスミド (例: 細菌、昆虫、哺乳類のタンパク質発現用) に導入する必要がある場合に使用されています。

ゲートウェイ クローンの最初のステップは、ゲートウェイ エントリ クローンを準備することです。エントリ クローンを作成するには、いくつかの方法があります。

1. Gateway attB1 および attB2 配列は、遺伝子特異的 PCR プライマーと PCR 増幅を使用して、それぞれ遺伝子フラグメントの 5' および 3' 末端に追加されます。PCR 増幅産物は、Gateway「ドナーベクター」(Invitrogen 用語) と呼ばれるプラスミドの独自の混合物と独自の「BP Clonase」酵素と混合されます。酵素混合物は、attB 配列を含む PCR 産物の Gateway ドナーベクターの attP 組換え部位への組換えおよび挿入を触媒します。カセットがターゲットプラスミドの一部である場合、Gateway 命名法では「エントリークローン」と呼ばれ、組換え配列は Gateway「attL」タイプと呼ばれます。
2. attL を含む短い末端は、DNA リガーゼを必要とせずに DNA 断片を特定のベクターにクローニングする技術である TOPO 法を使用して追加されます。
3. 目的の DNA 配列は、制限酵素を使用して attL を含むマルチクローニング サイトにクローニングできます。

Gateway クローニングの2 番目のステップは、Gateway Destination ベクターの準備です。発現クローンを準備する際には、ターゲットに最適なターゲット ベクターを選択することが重要です。その後、Gateway Entry クローンの遺伝子カセットは、独自の酵素ミックス「LR Clonase」を使用して、あらゆる Gateway Destination ベクター (Invitrogen の命名法では、Gateway「attR」組み換え配列とプロモーターやエピトープ タグなどの要素を含み、ORF を含まないあらゆる Gateway プラスミド) に簡単かつ効率的に移すことができます。何千もの Gateway Destination プラスミドが作成され、世界中の研究者の間で自由に共有されています。Gateway Destination ベクターは、制限酵素消化およびライゲーションを使用して目的の遺伝子を挿入する前に、複数のクローニング サイトを含む従来の発現ベクターに似ています。Gateway Destination ベクターは、Invitrogen、EMD ( Novagen )、および Covalys から市販されています。

Gateway クローニングの3 番目のステップは、目的の遺伝子を発現させるための準備です。発現クローンの完全性を確認するには、必ずシーケンシングまたは制限消化を使用してください。構築物が機能したら、調査に使用する予定の細胞を形質転換またはトランスフェクションできます。

Gateway クローニングでは、特許取得済みの組み換え配列と、Invitrogen からのみ入手可能な独自の酵素ミックスが使用されるため、この技術では研究者がベンダーを切り替えることができず、このような特許取得済みの手順すべてがロックイン効果をもたらします。

Gateway のクローン作成に含まれるさまざまな手順をまとめると次のようになります。

• ゲートウェイ BP 反応: attB 部位を挟んだ PCR 産物 (このステップでは、制限酵素処理などの他の DNA 分離方法も使用できます) + attP 部位を含むドナー ベクター + BP クロナーゼ => ゲートウェイ エントリー クローン (関心対象の遺伝子を挟んだ attL 部位を含む)
• ゲートウェイ LR 反応: attL サイトを含むエントリー クローン + attR サイト、プロモーター、タグを含むデスティネーション ベクター + LR クロナーゼ => attB サイト、目的の遺伝子の隣接を含み、遺伝子発現の準備が整った発現クローン。

• 柔軟性: 目的の DNA 配列は、エントリー クローンを作成すると、わずか 1 回の組み換えステップで任意の発現システムに移動できます。
• スピード: 従来の制限およびライゲーションクローニングでは 2 日以上かかるところ、Gateway アプローチではわずか 1 日で発現コンストラクトを作成できます。同じチューブで BP 反応と LR 反応を実行することで、attB-PCR 産物をすぐにターゲットベクターにクローニングすることもできます。クローニングプロセス中に制限、ライゲーション、ゲル精製の手順はありません。
• 複数フラグメントのクローニング: Gateway クローニングを使用すると、1 つのチューブ内の多数のベクターに複数の DNA 断片を同時に挿入できます。必要な発現クローンを作成するために、最大 4 つの DNA セグメントを 1 つのチューブ内で正確な順序と方向で 1 つの Gateway ベクターにクローニングできます。Gateway ベクターの設計により、これが可能になります。
• 高効率: ゲートウェイ クローニング法では、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを使用して、遺伝子のクローニングが成功する確率を高めます。つまり、プロセスがより効率的になり、成功する結果が生まれる可能性が高くなります。
• 汎用性: PCR 技術を使用して、あらゆる種類の DNA 断片をクローン化できます。クローン化は、哺乳類から細菌まで、さまざまな種類の生物で利用できます。

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