チャネルロドプシン

チャネルロドプシンは、光依存性イオンチャネルとして機能するレチニリデンタンパク質（ロドプシン）のサブファミリーです。^[1]チャネルロドプシンは単細胞緑藻類の感覚光受容体として機能し、光走性（光に反応する動き）を制御します。^{[2]他の生物の細胞で発現すると、光が}電気的興奮性、細胞内酸性度、カルシウム流入、およびその他の細胞プロセスを制御できるようになります（オプトジェネティクスを参照）。モデル生物クラミドモナス・ラインハルティのチャネルロドプシン-1（ChR1）とチャネルロドプシン-2（ChR2）は、最初に発見されたチャネルロドプシンです。異なる色の光に敏感であったり、特定のイオン（ACR、KCR）に選択的である変異体は、他の種の藻類や原生生物からクローン化されています。

微細藻類の光走性と光配向性は、世界中の多くの研究室で100年以上にわたって研究されてきました。1980年にケン・フォスターは藻類の目の機能性について初めて一貫した理論を開発しました。^{[3]彼はまた、公開された作用スペクトルを分析し、網膜および網膜類似体で盲細胞を補完し、緑藻類の運動反応の光受容体は}ロドプシンであるという結論に至りました。^[4]

緑藻類 ヘマトコッカス・プルビアリスとクラミドモナス・ラインハルティの光電流は、オレグ・シネシュチェコフとピーター・ヘゲマンのグループによって長年研究されてきた。^{[5] [6]}作用分光法と光電流および鞭毛拍動の同時記録に基づいて、光受容体電流とそれに続く鞭毛運動はロドプシンによって媒介され、光走性および光嫌悪反応を制御することが判明した。短い光フラッシュ後の光受容体電流の非常に急速な上昇から、ロドプシンとチャネルはタンパク質複合体、または1つのタンパク質内で密接に関連しているという結論に至った。^{[7] [8]}

この珍しい特性を強調するために「チャネルロドプシン」という名前が付けられ、それに応じて配列も改名された。現在チャネルロドプシン ChR1 および ChR2 と呼ばれるロドプシンのヌクレオチド配列は、C. reinhardtiiの大規模なEST配列決定プロジェクトでようやく発見された。3 つの研究グループが独立して同じ配列をGenBankに提出したため、命名に関する混乱が生じた。Hegemannのグループによる最初の提出ではcop-3およびcop-4という名前が使用され、^[9] Spudich のグループではcsoAおよびcsoB という名前が使用され、^[2] Takahashi のグループではacop-1およびacop-2 という名前が使用された。 ^{[10]両方の配列は、}アフリカツメガエルの卵母細胞およびヒト腎臓細胞(HEK)で単一成分の光活性化陽イオンチャネルとして機能することがわかった。^{[1] [11]}

^{藻類細胞における光受容体電流の生成におけるそれらの役割は、オレグ・シネシュチェコフ、クァン・ファン・ジョン、ジョン・スピュディッチ[2]、およびピーター・ベルトルドとピーター・ヘーゲマン[12]}によって特徴付けられました。

構造的には、チャネルロドプシンはレチニリデンタンパク質である。ロドプシンと同様に7回膜貫通型タンパク質で、光異性化可能な発色団オールトランスレチナール（ビタミンAのアルデヒド誘導体）を含む。レチナール発色団は、プロトン化されたシッフ塩基を介してタンパク質の残りの部分と共有結合している。ほとんどの7回膜貫通型タンパク質は、セカンドメッセンジャーを介して間接的に他のイオンチャネルを開くGタンパク質共役受容体であるのに対し（つまり、代謝型である）、チャネルロドプシンは直接イオンチャネルを形成する（つまり、イオン型である）。^[11]これにより、細胞の脱分極が極めて高速かつ堅牢になり、光刺激を含むバイオエンジニアリングや神経科学への応用に有用である。

天然（「野生型」）ChR2は、480 nmで吸収および作用スペクトルが最大となる青色光を吸収する。 ^[14]全トランスレチナール複合体が光子を吸収すると、全トランスから13-シスレチナールへの構造変化が誘発される。この変化により、膜貫通タンパク質にさらなる変化が導入され、少なくとも6Åまで孔が開く 。数ミリ秒以内に、レチナールは全トランス型に戻り、孔が閉じてイオンの流れが止まる。^[11]ほとんどの天然チャネルロドプシンは非特異的陽イオンチャネル（CCR）であり、H ⁺、Na ⁺、K ⁺、およびCa ²⁺イオンを伝導する。 陰イオン伝導チャネルロドプシン（ACR）^[15]およびカリウム選択性チャネルロドプシン（HcKCR1、HcKCR2）^[16]の構造が分析され、イオン選択性が理解された。^{[17] [18] ACRとKCRは神経活動を抑制するために使われてきました。最近発見されたウイルスチャネルロドプシン（VCR1）は}小胞体の膜に局在し、光が当たるとカルシウムの放出を引き起こします。^[19]

2005年、3つのグループが、ニューロン、神経回路、行動 の遺伝子標的光遠隔制御（オプトジェネティクス）ツールとしてChR2を順次確立しました。

当初、カール・ダイセロスの研究室は、ChR2 をin vitro で哺乳類のニューロンの制御に使用できることを実証し、ミリ秒単位の時間精度 (スパイクの遅延と時間的ジッターの両方の観点で) を達成しました。^[20]すべてのオプシンは光感知補因子としてレチナールが必要であり、哺乳類の中枢神経細胞が十分なレチナールレベルを含むかどうかは不明でしたが、実際には含まれています。また、単一チャネルのコンダクタンスが小さいにもかかわらず、哺乳類のニューロンを活動電位閾値以上に駆動するのに十分な効力があることも示されました。これにより、チャネルロドプシンは、ニューロンが動作する時間精度 (ミリ秒) で神経活動を制御できる最初の光遺伝学ツールになりました。後に、ニワトリの脊髄で脊椎動物のニューロンの活動を制御する ChR2 の能力を確認する 2 番目の研究が発表されました。 ^[21]この研究は、ChR2を光サイレンサー（この場合は脊椎動物のロドプシン-4）と一緒に発現させた最初の研究であり、異なる波長で組織を照射することで、これら2つのツールを同時に使用して興奮性細胞を活性化およびサイレンシングできることを初めて実証しました。

ChR2 は、特定のニューロンまたは筋細胞で発現すると、予測可能な行動を引き起こすことができる、つまり、無傷の動物、この場合は無脊椎動物のC. elegansの神経系を制御できることが実証されました。^[22]これは、光遺伝学実験で ChR2 を使用して動物の行動を誘導し、遺伝的に指定された細胞型を光リモートコントロールの対象にした最初の例でした。両方の側面は、その年の初めにGero Miesenböckのグループによって間接光ゲートイオンチャネル P2X2 を展開して実証されていましたが、^[23]それ以降、チャネルロドプシンなどの微生物オプシンが、ケージドリガンドなどの外部化合物を必要とせずに直接光活性化を行うパワー、スピード、ターゲット性、使いやすさ、および時間的精度により、興奮性細胞の遺伝子標的リモートコントロールの分野を支配しました。^[24]

ChR2の主な欠点である、単一チャネルのコンダクタンスが小さいこと (特に定常状態)、最適な励起波長が 1 つ (約 470  nm、青) に制限されていること、回復時間が比較的長いため 20～40 Hz を超えるニューロンの制御発火ができないことを克服するために、遺伝子工学を使用して ChR2 が最適化されました。点突然変異H134R (天然タンパク質の位置 134 のアミノ酸ヒスチジンをアルギニンに交換) により定常状態のコンダクタンスが増加しました。これは 2005 年の論文で説明されており、この論文では ChR2 がC. elegansの光遺伝学ツールとしても確立されました。^[22] 2009年、ロジャー・ツィエンの研究室は、ChR1とChR2のキメラを作成し、特定のアミノ酸を変異させることで、定常コンダクタンスをさらに高め、脱感作を大幅に減らすためにChR2を最適化し、最大100Hzの活動電位の列を駆動できるChEFとChIEFを生み出しました。^{[25] [26]} 2010年、ヘーゲマンとデイセロスのグループは、ネイティブChR2にE123T変異を導入し、オンとオフの速度が速いChETAを生み出し、最大200Hzの周波数で個々の活動電位を制御できるようにしました （適切な細胞タイプの場合）。^{[27] [25]}

ヘーゲマンとデイセロスのグループは、点変異 C128S を導入すると、結果として得られる ChR2 誘導体がステップ関数ツールになることも発見しました。青色光によって「スイッチオン」されると、ChR2(C128S) は黄色光によってスイッチオフされるまで開いた状態のままになります。この変更により時間精度は低下しますが、光感度は 2 桁増加します。^[28]彼らはまた、多細胞藻類Volvox carteriで VChR1 を発見し、その特徴を明らかにしました。VChR1 はごくわずかな光電流しか生成しませんが、吸収スペクトルは ChR2 に比べて赤方偏移しています。^[29] ChR1 配列の一部を使用して、光電流の振幅が後に改善され、2 つの異なる波長で 2 つのニューロン集団を励起できるようになりました。^[30]

デイセロスのグループは、生体内でのげっ歯類 の遺伝子標的遠隔制御^[31]、げっ歯類の学習の光遺伝学的誘導^{[32] 、ラットの}パーキンソン病の実験的治療^[33]、^{[34] 、} fMRI（オプトfMRI）との組み合わせ^[35]など、生きた動物への多くの応用を開拓してきました。他の研究室では、全光学実験のためのカルシウムイメージングとChR2刺激の組み合わせ^[36] 、長距離^[37]および局所^[38]神経回路のマッピング、トランスジェニック遺伝子座からのChR2発現（直接^[39]またはCre-lox条件付きパラダイム^[38]）、および個々の細胞の活性化を可能にするChR2の2光子励起[40]を開拓してきました。^{[ 41] [42]}

2013年3月、バンベルク、ボイデン、ダイセロス、ヘーゲマン、ミーゼンベック、ナーゲルは「オプトジェネティクスの発明と改良」によりブレイン賞（グレーテ・ルンドベック欧州脳研究賞）を共同で受賞した。^[43]同年、ヘーゲマンとナーゲルは「チャネルロドプシンの発見」によりルイ・ジャンテ医学賞を受賞した。2015年、ボイデンとダイセロスは生命科学におけるブレークスルー賞を受賞し、2020年にはミーゼンベック、ヘーゲマン、ナーゲルがオプトジェネティクスの開発により生命科学と医学におけるショー賞を受賞した。

チャネルロドプシンはオプトジェネティクスの重要なツールです。チャネルロドプシン2のC末端は細胞内空間に伸びており、チャネル機能に影響を与えることなく蛍光タンパク質に置き換えることができます。この種の融合構造は、ChR2発現細胞の形態を視覚化するために役立ちます。つまり、どの細胞がFPでタグ付けされているかを同時に示し、チャネルロドプシンによってその活動を制御できるようにします。^{[20] [36]網膜結合ポケットに近い} 点突然変異はチャネルロドプシンの生物物理学的特性に影響を与えることが示されており、さまざまな異なるツールを生み出しています。

光活性化後のチャネルの閉鎖は、タンパク質残基C128またはD156を変異させることによって大幅に遅らせることができる。この改変により、青色光パルスによって開き、緑色または黄色の光パルスによって閉じることができる超高感度チャネルロドプシンが得られる（ステップ機能オプシン）。^{[28] [44] [30]} E123残基を変異させるとチャネル運動が加速され（ChETA）、結果として生じるChR2変異体は、最大200Hzでニューロンをスパイクするために使用されている。^[27]一般に、運動が遅いチャネルロドプシンは、低光レベルでも時間の経過とともに開いたチャネルが蓄積するため、集団レベルではより光に敏感である。

H134RおよびT159C変異体は光電流の増加を示し、T159とE123（ET/TC）の組み合わせは野生型ChR2よりもわずかに大きな光電流とわずかに速い速度を示します。 ^[45] ChR1とChR2のキメラおよびポイント変異体であるChIEFは、大きな光電流、ほとんど脱感作がなく、野生型ChR2と同様の速度を示します。^[25]開放時間が延長された変異体（ChR2-XXL）は、非常に大きな光電流を生成し、集団レベルで非常に光に敏感です。^[46]

キメラチャネルロドプシンは、ChR1とVChR1の膜貫通ヘリックスを組み合わせることで開発され、赤色のスペクトルシフトを持つChR（C1V1やReaChRなど）の開発につながりました。^{[30] [47] ReaChRは膜輸送を改善し、哺乳類細胞で強力に発現し、脳幹運動}ニューロンの低侵襲性経頭蓋活性化に使用されています。他の生物における相同配列の探索により、スペクトルが改善され、より強力な赤色シフトチャネルロドプシン（Chrimson）が得られました。^[48]これらの黄色/赤色光感受性チャネルロドプシンは、ChR2と組み合わせることで、異なる色の光パルスで2つのニューロン集団を独立して制御できます。^{[49] [50]}

藻類シェルフェリア・デュビアから青方偏移したチャネルロドプシンが発見された。膜輸送と速度を改善するためにいくつかの改良を行った後、結果として得られたツール（CheRiff）は460 nm励起で大きな光電流を生成した。^{[51]これは、遺伝子コード化カルシウム指示薬jRCaMP1b [52]}と組み合わせられ、OptoCaMPと呼ばれる全光学システムに組み込まれた。^[53]

チャネルロドプシンのほとんどは非特異的な陽イオンチャネルである。ニューロンで発現すると、主にNa ⁺イオンを伝導するため、脱分極性（興奮性）となる。中程度から高いカルシウム透過性を持つ変異体が作製されている（CatCh、CapChR）。^{[54] [55]} K ⁺特異的チャネルロドプシン（KCR、WiChR）は最近、さまざまな原生生物で発見された。^{[56] [57]}ニューロンで発現すると、カリウム選択性チャネルロドプシンは光照射により膜を過分極させ、スパイク生成を防ぐ（抑制性）。

E90を正に帯電したアミノ酸アルギニンに変異させると、チャネルロドプシンは非特異的陽イオンチャネルから塩化物伝導チャネル（ChloC）に変わります。^[58]チャネル孔内の負に帯電した残基を置き換えることでCl-に対する選択性がさらに向上し、逆転電位がより負になりました。^{[59] [60]} 陰イオン伝導チャネルロドプシン（iChloC、iC++、Gt ACR）は、青色光を照射すると、細胞培養および無傷の動物におけるニューロンのスパイクを阻害します。カルシウム選択性チャネルロドプシンは、細胞内のカルシウム依存性酵素を活性化するように設計されました。^[61]

チャネルロドプシンは、さまざまなトランスフェクション技術（ウイルストランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃）またはトランスジェニック動物を使用して、ニューロンなどの興奮性細胞で容易に発現できます。光を吸収する色素レチナールは、ビタミン Aとして（脊椎動物の）ほとんどの細胞に存在するため、化学物質を添加せずにニューロンを光刺激することができます。チャネルロドプシンが発見される前は、神経科学者は脳内のニューロンの活動を記録し、この活動と行動を相関させることしかできませんでした。これでは、記録された神経活動が実際にその行動を引き起こしたことを証明するには不十分です。遺伝子組み換え細胞のネットワークを光で制御する、オプトジェネティクスと呼ばれる新しい分野により、研究者は現在、特定のニューロングループの活動と精神的イベント（意思決定など）との因果関係を調査できるようになりました。行動の光制御は、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウスで実証されています。^{[62] [63]}最近、塩化物伝導チャネルロドプシンが人工的に作られ、自然界でも発見されました。^{[15] [58]これらのツールは、}阻害を遮断することで細胞培養や生きた動物のニューロンを沈黙させるために使用することができます。^{[59] [60]}

複数の色の光を使用すると、オプトジェネティクス実験の可能性が広がります。青色光に敏感なChR2と黄色光で活性化する塩素ポンプハロロドプシンを組み合わせることで、神経活動の多色光活性化とサイレンシングが可能になります。^{[64] [65]}もう一つの興味深い組み合わせは、青色光に敏感な塩素チャネルGt ACR2 ^[66]と赤色光に敏感な陽イオンチャネルChrimson ^[67]で、これらは膜電位の双方向制御のために単一のタンパク質（BiPOLES）に統合されています。^[68]

蛍光標識されたChR2を使用すると、光刺激を受けた軸索とシナプスを識別できます。^{[36]これは、}シナプス可塑性の誘導中に起こる分子イベントを研究するのに役立ちます。^{[69] [70]} トランスフェクトされた培養神経ネットワークは、ロボット工学や制御への応用のために、いくつかの望ましい動作を実行するように刺激することができます。^[71] ChR2は、脳の片側からもう片側への長距離接続をマッピングしたり、個々のニューロンの樹状突起上の入力の空間位置をマッピングしたりするためにも使用されています。^{[37] [72]}

2006年には、チャネルロドプシンを導入することで失明したマウスの視力を回復できることが報告された。^[73]

ニューロンは長期間にわたってChRの発現に耐えることができ、いくつかの研究室では医療ニーズを解決するために光遺伝学的刺激を試験している。盲目のマウスでは、網膜内細胞でChR2を発現させることで視覚機能を部分的に回復させることができる。^{[74] [75]} 2021年には、赤色光に敏感なChR ChrimsonRが、網膜変性症（網膜色素変性症）を患っている人間の患者の目にウイルスで送達され、視力の部分的な回復につながった。^{[76] [77]}光人工内耳は動物実験でうまく機能することが示されており、現在臨床試験が行われている。^{[78] [79] [80]将来的には、}パーキンソン病患者の深部脳刺激や特定のてんかんの制御など、ChRはさらに多くの医療用途に使われるようになるかもしれない。

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