アグロバクテリウム・ツメファシエンス

アグロバクテリウム・ツメファシエンス^{[ 3 ] [ 2 ]}は、 140種以上の真正双子葉植物の根頭がん病（腫瘍の形成の原因菌です。これは桿状のグラム陰性土壌細菌です。 ^{[ 6 ]}症状は、プラスミドから植物細胞に小さなDNA断片（ 「転移DNA」を意味するT-DNAとして知られ、タンパク質合成中にアミノ酸を転移するtRNAと混同しないように注意）^{が挿入されることによって引き起こされます[ 9 ]} 。この断片は植物ゲノムの半ランダムな場所に組み込まれます。植物ゲノムは、T-DNAバイナリベクターにホストされている配列をアグロバクテリウムに導入することによって操作できます。

アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、窒素固定を行うマメ科植物の共生菌を含むリゾビウム科のアルファプロテオバクテリアである。窒素固定を行う共生菌とは異なり、腫瘍を形成するアグロバクテリウム種は病原性があり、植物に利益をもたらさない。アグロバクテリウムが影響を与える植物の種類が非常に多いため、農業産業にとって大きな懸念となっている。^{[ 10 ]}

経済的には、A. tumefaciensはクルミ、ブドウ、核果類、ナッツ類、テンサイ、ワサビ、ルバーブの深刻な病原菌であり、この病気によって引き起こされる腫瘍やこぶの持続性により、多年生作物に特に有害である。^{[ 11 ]}

アグロバクテリウム・ツメファシエンスは28 ℃（82 °F）で最適に生育します。倍加時間は培地、培養形式、通気レベルによって2.5～4時間の範囲になります。^{[ 12 ]} 30 ℃（86 °F）を超える温度では、A.ツメファシエンスは熱ショックを受け始め、細胞分裂のエラーにつながる可能性があります。^{[ 12 ]}    

アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよび関連種（総称してアグロバクテリウム・ツメファシエンス種複合体）の分類は、植物科学者が用いる用語の変化をはるかに上回るペースで進んでいる。

1980年以前は、アグロバクテリウムの分類は主に病気の症状と宿主範囲を反映していた。A . radiobacterは「非病原性」種、A. tumefaciensは根頭がん腫を引き起こす種、 A. rhizogenesは毛状根病を引き起こす種、 A. rubiはサトウキビがん腫を引き起こす種と定義されていた。^{[ 13 ]}

Tiプラスミドの発見により、症状は主に保有するプラスミドの特定のバージョンに依存し、生物学的種概念に似たものではないことが明らかになった。2000年までに、成長と代謝特性を用いた「バイオバー」概念により、アグロバクテリウムは3つのバイオバーに分類され、後に遺伝的差異とほぼ一致することが示された。^{[ 13 ]}バイオバー1はアグロバクテリウムに、バイオバー2はリゾビウム・リゾゲネスに、バイオバー3はアロリゾビウム・ヴィティスに留まる。2014年までに、厳密な意味でのアグロバクテリウムが何を指すかについての混乱はほとんど、あるいは全くない。 ^{[ 14 ]}

しかし、バイオバー1内の分類、特にAgrobacterium tumefaciens種複合体内の分類には別の問題が残っており、DNAシーケンスなしでは生物学的種を区別することが困難です。研究者の多くは依然として症状に基づく古い命名法に固執しており、この複合体内の「ゲノムバー」または「ゲノム種」を区別するために時間を費やす少数の研究者を除いては、ほとんどがそうでした。^{[ 15 ]}さらに混乱を招くことに、1980年の承認リストでは、説明なしにA. tumefaciensのタイプ株が「B6」に変更されました。これは現在、 Agrobacterium radiobacter（ゲノムバー4）として正しく分類されている株であり、誤解した研究者が2つの同義語を提案する原因となりました。^{[ 2 ]} 2023年に復活したA. tumefaciensの元のタイプ株は、ゲノムバー1に属します。^{[ 15 ]}

初期の研究でよく使われた「A. tumefaciens」の別の株は、ゲノム型8に属するC58でした。種複合体の現在知られている構造のレビューについては、Vargas Ribera et al. (2024) を参照してください。このレビューでは、ゲノム型に個別に提案された名前もリストされています。^{[ 15 ]}

この記事では、ゲノム型を区別していない多くの情報源を引用している。この記事のほとんどの部分は、種複合体全体を記述したものとして扱うべきである。

病原性を持つためには、この細菌は、T-DNAとそれを植物細胞に転移させるのに必要なすべての遺伝子を含む、長さ200 kbpの腫瘍誘発プラスミド（TiプラスミドまたはpTi）を持っている。 ^{[ 16 ]} A. tumefaciensの多くの株はpTiを持っていない。

Tiプラスミドは病気を引き起こすために必須であるため、根圏では細菌接合（細菌間でのプラスミドの交換）を促進するために前侵入イベントが発生します。オピンが存在すると、A. tumefaciensはN- (3-オキソ-オクタノイル)-L-ホモセリンラクトン（3OC8HSL）またはアグロバクテリウムオートインデューサーと呼ばれる拡散性接合シグナルを生成します。^{[ 17 ]}これにより転写因子TraRが活性化され、接合に必要な遺伝子の転写が正に制御されます。^{[ 18 ]}

アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、 Tiプラスミドを介して植物に感染します。Tiプラスミドは、T-DNAとして知られるDNA断片を宿主植物細胞の染色体DNAに組み込みます。A .ツメファシエンスは鞭毛を持ち、根の周りの根圏に蓄積する光合成産物に向かって土壌中を泳ぎます。一部の株は、アセトシリンゴンや糖類などの植物からの化学的滲出物に向かって化学走性的に移動することがあり、これは細菌が侵入する可能性のある植物の傷の存在を示します。フェノール化合物は、Tiプラスミド上のvirA遺伝子にコードされている膜貫通タンパク質であるVirAタンパク質によって認識されます。糖類は、ペリプラズム空間に存在する染色体遺伝子にコードされているタンパク質であるchvEタンパク質によって認識されます。^{[ 13 ]}

Tiプラスミド上の少なくとも25個のvir遺伝子が腫瘍誘導に必要である。 ^{[ 19 ]} virAとchvEは認識の役割に加えて、他のvir遺伝子を誘導する。VirAタンパク質は自己キナーゼ活性を持ち、ヒスチジン残基で自身をリン酸化する。次に、VirAタンパク質はVirGタンパク質のアスパラギン酸残基をリン酸化する。virGタンパク質は、 virG Tiプラスミド遺伝子から産生される細胞質タンパク質である。これは転写因子であり、 virオペロンの転写を誘導する。ChvEタンパク質はvir遺伝子の活性化の2番目のメカニズムを調節する。これはVirAタンパク質のフェノール化合物に対する感受性を高める。^{[ 13 ]}

付着は2段階のプロセスです。最初の弱く可逆的な付着の後、細菌はセルロース繊維を合成し、引き寄せられた傷ついた植物細胞に固定します。このプロセスには、chvA、chvB、pscA、attの4つの主要な遺伝子が関与しています。最初の3つの遺伝子の産物は、セルロース繊維の実際の合成に関与していると考えられます。これらの繊維は細菌同士を固定し、微小コロニーの形成を助けます。

最も重要な病原性タンパク質であるVirCは、非合法的な再定着における組換えに不可欠なステップである。VirCは宿主植物のDNAのうち、置き換えられる部分を選択し、そのDNA鎖を切断する。

セルロース繊維の生成後、リカドヘシンと呼ばれるカルシウム依存性の外膜タンパク質が生成され、これが細菌を細胞壁に付着させるのにも役立ちます。このタンパク質の相同体は他の根粒菌にも見られます。現在、アグロバクテリウムを介した形質転換のプロトコルの標準化に関する報告がいくつかあります。感染時間、アセトシリンゴン、DTT、システインなどのさまざまなパラメーターの影響がダイズ（ Glycine max ）で研究されています。^{[ 20 ]}

アグロバクテリウムが植物細胞に感染するのを誘発する可能性のある植物化合物： ^{[ 21 ]}

• アセトシリンゴンおよびその他のフェノール化合物
• α-ヒドロキシアセトシリンゴン
• カテコール
• フェルラ酸
• 没食子酸
• p-ヒドロキシ安息香酸
• プロトカテキュ酸
• ピロガリン酸
• レゾルシル酸
• シナピン酸
• シリンガ酸
• バニリン

T-DNAの植物細胞への導入

T-DNAは環状プラスミドから切り出されなければならない。これは通常、ヘルパープラスミド内のVir遺伝子によって行われる。^{[ 23 ]} VirD1/D2複合体は、左右の境界配列でDNAにニックを入れる。VirD2タンパク質は5'末端に共有結合している。VirD2には、ヌクレオプロテイン複合体がIV型分泌系（T4SS）に標的化されるモチーフが含まれている。T線毛の構造は、線毛の中央チャネルが狭すぎて折り畳まれたVirD2の転送ができないことを示しており、接合過程中にVirD2が部分的にほどける必要があることを示唆している。^{[ 22 ]}

受容細胞の細胞質では、T-DNA複合体はVirE2タンパク質で覆われ、T-DNA複合体とは独立してT4SSを介して細胞質に輸送される。VirE2 とVirD2に存在する核局在シグナル（NLS）は、インポーチンαタンパク質によって認識され、インポーチンαはインポーチンβおよび核膜孔複合体と結合してT-DNAを核内に輸送する。VIP1もこの過程において重要なタンパク質であると考えられ、おそらくVirE2をインポーチンに導くアダプターとして機能している。核内に入ると、VIP2はT-DNAを活発に転写されているクロマチン領域に標的化し、T-DNAが宿主ゲノムに組み込まれるようにする。

1975年のアシロマ会議では、組換え技術は十分に理解されておらず、厳密に管理する必要があるという点で広く合意が確立されました。^{[ 30 ] [ 31 ]}アグロバクテリウムのDNA伝達能力は、植物に外来遺伝子を挿入する手段としてバイオテクノロジーで広く研究されてきました。アシロマ会議の直後、マーク・ヴァン・モンタギュとジェフ・シェルは、アグロバクテリウムと植物間の遺伝子伝達メカニズムを発見し、その結果、細菌を植物の遺伝子工学のための効率的な送達システムに変える方法が開発されました。^{[ 32 ]}植物に伝達されるプラスミドT-DNAは、遺伝子工学の理想的な媒体です。^{[ 33 ]}これは、目的の遺伝子配列をT-DNAバイナリベクターにクローニングし、そのベクターを使用して目的の配列を真核細胞に送達することによって行われます。このプロセスは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を使用して発光植物を生成するために実行されました。 ^{[ 34 ]}この発光は、植物の葉緑体機能の研究やレポーター遺伝子として有用な装置となっている。^{[ 34 ]}また、アグロバクテリウムの培養液に花を浸すことでシロイヌナズナを形質転換することも可能であり、生成された種子は形質転換体となる。実験室条件下では、T-DNAはヒト細胞にも導入されており、挿入応用の多様性を示している。^{[ 35 ]}

アグロバクテリウムが宿主細​​胞に物質を挿入するメカニズムは、 IV型分泌系によるものであり、これは病原体がIII型分泌系を用いてヒト細胞に物質（通常はタンパク質）を挿入するメカニズムと非常によく似ている。また、多くのグラム陰性細菌に保存されているクオラムセンシングと呼ばれるシグナル伝達機構も利用している。このため、アグロバクテリウムは医学研究においても重要な研究対象となっている。

細菌における自然遺伝子形質転換は、介在する培地を介してDNAが一方の細胞から他方の細胞へ伝達され、相同組換えによってドナー配列が受容ゲノムに組み込まれるという有性生殖プロセスである。A . tumefaciensは、特別な物理的または化学的処理なしに土壌中で自然形質転換を起こすことができる。^{[ 36 ]}

アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、感染した土壌で越冬します。アグロバクテリウム属は主に腐生生活を送るため、この属の植物寄生種であっても、宿主植物が存在しない場合でも、土壌中で長期間生存することはよくあります。^{[ 37 ]}しかし、宿主植物が存在する場合、細菌は、地表近くの根や茎の最近の傷や自然な開口部を介して植物組織に侵入します。これらの傷は、栽培方法、接ぎ木、昆虫などによって引き起こされる可能性があります。細菌が植物に侵入すると、細胞間作用を起こし、細胞形質転換によって周囲の組織の増殖を刺激します。アグロバクテリウムはこの制御を、プラスミドT-DNAを植物のゲノムに挿入することによって行います。宿主ゲノムへのプラスミドDNA挿入のプロセスの詳細については、上記を参照してください。植物組織の過剰な成長は、茎や根にこぶの形成につながります。これらの腫瘍は周囲の植物組織に大きな圧力をかけ、その結果、組織が押しつぶされたり変形したりします。押しつぶされた導管は、木部における水の流れを減少させます。若い腫瘍は柔らかいため、昆虫や腐生微生物による二次侵入を受けやすいです。この二次侵入により、周辺細胞層が破壊され、腐敗により腫瘍が変色します。柔らかい組織が破壊されると、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが土壌中に放出され、新たな宿主植物で病気のプロセスが再開されます。^{[ 38 ]}

アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって引き起こされる根頭がん病は、さまざまな方法で防除できます。この病気を防除する最良の方法は、新しい植物への感染を防ぐために剪定道具を消毒するなど、予防措置を講じることです。苗床の義務的な検査を実施し、感染した植物を拒否すること、および感染した畑に感受性のある植物を植えないことも有効な対策です。栽培中に植物の根元や根を傷つけないようにすることは、病気を予防するために重要です。芽接ぎや接ぎ木^{[ 39 ]}のように、複数の植物を1つに成長させる園芸技術では、これらの技術によって植物に傷が生じます。傷は、細菌が宿主植物に侵入する主な場所です。したがって、アグロバクテリウムが活動していない時期にこれらの技術を実行することが推奨されます。根を食害する昆虫は植物の根に傷（つまり細菌の侵入口）を作るため、これらの昆虫を防除することも感染レベルを下げるのに役立ちます。 ^{[ 38 ]}細菌は土壌中で長年生存できるため、感染した植物材料は堆肥の山に入れるのではなく焼却することが推奨される。^{[ 40 ]}

この病気の管理には生物的防除法も利用されています。1970年代から1980年代にかけて、発芽した種子、苗、台木を処理する一般的な方法は、K84の懸濁液に浸すことでした。K84はRhizobium rhizogenes ^{[ 41 ]}（以前はA. radiobacterに分類されていましたが、後に再分類されました）の株で、 A. tumefaciensに関連する種ですが、病原性はありません。K84は、 A. tumefaciensを含む関連細菌に特異的な抗生物質であるバクテリオシン（アグロシン84）を産生します。この方法は商業規模で病気を制御するのに成功しましたが、K84が耐性遺伝子を病原性アグロバクテリアに伝達するリスクがありました。そのため、1990年代には、 K84を基にしたK1026として知られる欠失変異株が作成されました。この系統は、耐性遺伝子伝達の制約なしに、K84と同様に根頭がんの防除に成功している。^{[ 42 ] [ 43 ]}

宿主、環境、病原体は、植物病理学において非常に重要な概念です。アグロバクテリウムは、あらゆる植物病原体の中で最も広い宿主範囲を持ち、^{[ 44 ]}根頭がんの場合に考慮すべき主な要因は環境です。A . tumefaciens がさまざまな宿主に感染する際に、好ましい環境を作るさまざまな条件と要因があります。細菌は、傷などの侵入点がなければ宿主植物に侵入できません。植物に傷を生じさせる要因には、栽培方法、接ぎ木、凍害、成長のひび割れ、土壌昆虫、および植物に損傷を与える環境中の他の動物などがあります。したがって、非常に厳しい冬には、天候による損傷のために根頭がんの発生率が高くなることが一般的です。^{[ 45 ]}これに加えて、宿主植物の感染を媒介する方法があります。たとえば、線虫は、アグロバクテリウムを植物の根に導入するベクターとして機能します。より具体的には、根寄生性線虫が植物細胞を損傷し、細菌が侵入するための傷を作ります。^{[ 46 ]}最後に、 A. tumefaciens感染を考える際には温度も要因となります。この細菌による根頭がん形成の最適温度は、 T-DNA 転移の温度感受性のため22 °C (72 °F)です。高温条件下では腫瘍形成が大幅に減少します。^{[ 47 ]}  

• suhB

• ウィキメディア・コモンズにあるアグロバクテリウム・ツメファシエンス関連のメディア
• 「アグロバクテリウム・ファブラム」C58ゲノムページ — セレオン・ゲノミクス／リッチモンド大学による配列決定