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仮想コロニーカウント( VCC ) は、もともとディフェンシンの活性を測定するために開発された、96 ウェルの動態微生物学的アッセイです。[ 1 ]その後、 LL-37を含む他の抗菌ペプチド にも適用されています。[ 2 ] これは、細菌バッチ培養が閾値光学密度に達するまでの時間と一連の校正曲線のそれを比較する、定量的成長動態と呼ばれる細菌計数法を利用します。VCC という名称は、細胞培養感染モデルで細菌を計数するための定量的成長動態の適用を説明するためにも使用されています。[ 3 ] 抗菌薬感受性試験 (AST) は、細菌を接種したブロスで抗菌剤をさまざまな濃度に希釈し、増殖が起こらない最小阻害濃度を測定することにより、96 ウェルプレートで行うことができます。ただし、これらの方法は、ブロス自体によって阻害される一部の膜活性抗菌ペプチドの研究には使用できません。仮想コロニー計数法は、この事実を利用して、まず細菌細胞を低塩緩衝液中で活性抗菌剤に2時間曝露し、次に培養液を加えることで抗菌活性を阻害すると同時に指数関数的な増殖を誘導します。その後、温度制御プレートリーダーを用いて生存細胞の増殖速度をモニタリングします。各増殖曲線が光学密度の閾値変化に達するまでの時間を仮想生存値に変換し、これを抗菌活性の指標とします。
抗菌剤の抗菌活性を試験する方法は、何十年も前から存在しています。[ 4 ] [ 5 ] 通常、これらの方法は、細菌を抗菌剤に曝露し、細菌が活発に増殖できる栄養素が存在する状態で実施します。実験は、固体支持体として寒天を含むプレート、または寒天を含まない液体培地で実施できます。[ 6 ]これらの方法を使用して、 多くの低分子抗生物質が開発されました。しかし、研究者が一部の抗菌ペプチドの抗菌活性を研究したい場合、寒天プレートまたは液体培地のいずれで供給されても、豊富な培地によって阻害されるため、問題が生じます。たとえば、ディフェンシンは、ヒトを含む多くの生物の自然免疫系の一部である抗菌ペプチドです。これらは、ジスルフィド結合のパターンに基づいて、アルファ、ベータ、シータなどのいくつかの構造クラスに分類されます。好中球の顆粒には4種類のヒトαディフェンシンが存在し、これらはヒト好中球ペプチド（HNP）1-4として知られています。ディフェンシンの研究のごく初期に、HNPは生理的塩濃度によって強く阻害されることが発見されました。HNPの抗菌活性を測定するには、生存細胞数を数えるためにリッチ培地を加える前に、低塩緩衝液中で細胞と別個の初期ステップとしてインキュベートする必要がありました。生理的に関連する塩濃度の存在下でディフェンシンHNP1などのペプチドを測定する方法はないため、HNP1活性を測定するアッセイはすべて、体内の条件とは異なる条件を使用しています。
液体中の抗菌活性を測定するために一般的に用いられる方法の 1 つは、抗菌剤を 2 時間などのインキュベーション時間中に細胞に曝露し、その後、混合物を希釈して液体の一部をリッチ培地を含む寒天プレートに塗布することにより生存細胞を計数することです。[ 2 ]インキュベーションステップは通常 96 ウェルプレートで行われます。塗布後、寒天プレートは一晩インキュベートされ、翌日にコロニー形成単位 (CFU) の数が計数されます。これらの方法には、希釈ステップで不正確さが生じることや、プレートあたり許容できる数のコロニーを生成するために多数の寒天プレートが必要になる可能性があることなど、いくつかの欠点があります。[ 7 ] ディフェンシンなどの抗菌剤の抗菌活性を測定するには、2 時間のインキュベーションステップは、10 mM リン酸ナトリウム pH 7.4 などの低塩緩衝液で行われることに注意してください。
液体中の抗菌活性を測定するために一般的に用いられる別の方法は、96 ウェル プレート内の Mueller-Hinton ブロス (MHB) などのリッチ ブロス中の細胞に抗菌剤の希釈系列を曝露し、96 ウェル プレートを 37 °C で一晩インキュベートすることです。各ウェルは細菌の増殖により濁るか、透明なままになります。最小阻害濃度 (MIC) は、透明なウェルを生成し、増殖を阻害する最低濃度として報告されます。[ 8 ] MHB を使用した標準化された MIC 法は、ディフェンシンなどの抗菌剤には適用できません。ディフェンシンは、その活性を測定するためにリッチ ブロスではなく、低塩緩衝液でインキュベートする必要があるためです。
従来のコロニーカウント法を改良することで、低塩緩衝液中で2時間培養した後、等量の2倍濃度の培養液を添加するだけで、96ウェルプレート内での抗菌活性を測定できるようになります。この場合、ウェルから細胞を採取して寒天培地に塗布する必要はありません。バッチ培養を用いて、培養期間終了時に生存した細胞数を決定する方法が必要となります。幸いなことに、指数関数的増殖の数学は、まさにそれを実現する方法を提供します。96ウェルプレート内のバッチ培養液の濁度（光学密度）をリアルタイムで監視し、ウェルが閾値に達するまでの時間を記録し、指数関数的に増殖する細胞の倍加時間が分かれば、接種液中に元々存在していた細胞数を計算できます。この初期細胞数は、抗菌剤との2時間の培養終了時に生存している細胞数に等しくなります。この手順では実際のコロニー形成やコロニー数の計数が不要なため、「仮想コロニー計数法」と呼ばれています。これまでのところ、VCC法は抗菌ペプチドに限定されています。2倍濃縮したミュラーヒントン培地が抗菌剤の抗菌活性を不活化する限り、他の抗菌剤にも適用できる可能性があります。VCC法は殺菌活性または静菌活性を検出できますが、両者を区別することはできません。ただし、静菌活性は「入力」コントロールと「出力」コントロールの閾値時間の差を測定することで定量化できます（下記参照）。
2 mLの細菌培養液を単一コロニーから接種し、リン酸ミュラーヒントン（PMH）またはリン酸ミュラーヒントントリプシンソイブロス（PMHT）培地で一晩培養する。PMHは、ミュラーヒントンブロスと10 mMリン酸ナトリウムpH 7.4の1:1混合物である。カチオン調整済みまたはカチオン調整されていないMHBのいずれも使用できる。一部の実験では、2時間のインキュベーション中にディフェンシン活性を高めるために、リン酸緩衝液に1%トリプシンソイブロス（TSB）が存在していた。この場合、緩衝液とブロスの同様の1:1混合物には0.5% TSBが含まれており、PMHTと呼ばれる。この培養液250 μlを125 mL使い捨てフィルターフラスコ内の25 mLのPMHに移す。この培養は、 培養液の 650 nm での吸光度 が 0.45 ～ 0.55 になるまで、通常 2～3 時間 250 rpm で 37 °C で培養します。一方、抗菌ペプチドは、最終容量が 90 マイクロリットルになるように、96 ウェルプレート (Costar 3595、組織培養処理済み) で 10 mM リン酸ナトリウム pH 7.4 で希釈されます。仮想コロニー形成単位、または CFUv は、元の VCC 出版物[ 1 ]で定義されており、その定義をここで繰り返します。CFUv は、試験した 6 つの株間で一定に保たれ、各実験での濁度、つまり細胞膜の量がほぼ等しくなるようにしました。CFUv はEscherichia coli ATCC 25922の CFU に標準化されているため、この株では CFUv ではなく CFU を報告できます。アッセイの実験部分では、細胞を 10 mM リン酸ナトリウム pH 7.4 で希釈し、10 マイクロリットル中の最終細胞濃度が 500 万 CFUv/mL になるようにします。この細胞懸濁液 10 μl を、溶液中の抗菌ペプチド 90 μl の下にピペットで添加し、細胞を抗菌ペプチドに曝露する際に、標準接種量 5 × 10 5 CFUv/mL の細胞懸濁液とします。96 ウェルプレートのいくつかのウェルは、抗菌剤に曝露しないコントロールに使用されます。これらは「出力」コントロールと呼ばれます。次に、96 ウェルプレートをプレートリーダーで 2 時間インキュベートし、振とうして 5 分ごとに読み取ります。このインキュベーション時間中、シード培養は氷上に保管しました。キャリブレーション曲線を作成するために、2 時間のインキュベーション後、1 mL のシード培養を 1.5 mL の PMH に加えて、10 8 CFUv/mL の懸濁液を生成しました。この懸濁液の 10 倍希釈系列を作成し、PMH の総容量 200 μl で 10 7～ 10 0 CFUv/ml の範囲で、96 ウェル プレートの 8 ウェルを占めた。この時点で、抗菌剤に曝露されていない細胞を氷上で保存した培養物からプレートのいくつかのウェルに添加した。これらは、2 時間のインキュベーションの開始時に存在する細胞数を示すため、「入力」コントロールと呼ばれる。最初に発表された VCC 実験[ 1 ]12 時間のインキュベーション中に蒸発によって端のウェルの容量が変化するため、プレートの内側の 60 ウェルのみを使用しました。ただし、プレートの端を長さ 6 マス、幅 1/2 マスの Parafilm M で包めば、96 ウェル プレートの 96 ウェルすべてを実験に使用できます。ガス透過性の Parafilm は、細胞呼吸を許容しながら蒸発を遅らせ、プレート リーダー内の 96 ウェル プレートに微粒子が吹き込まれるのを防ぎます。プレートを Parafilm で包んだら、バイオセーフティ キャビネットからプレート リーダーに移します。温度制御プレート リーダーのいくつかモデルが VCC アッセイで正常に使用されており、これには、暖かい部屋に保管された Molecular Devices Vmax、Molecular Devices Spectramax、および Tecan Infinite M1000 が含まれます。プレート リーダーは、12 時間にわたって 5 分ごとに 650 nm の吸光度を読み取るように設定され、各読み取りの前に振とうします。生データはMicrosoft Excelにインポートされ、そこでマクロVCC Calculateが実行され、各成長曲線が閾値光学密度0.02に達するのに必要な時間が決定されます。
VCCが使用する生存細胞の計数法[ 9 ]は、定量的増殖速度論（QGK）と呼ばれています。これは、96ウェルマイクロプレートのウェル内の細菌バッチ微生物培養物の濁度が閾値の濁度差に達するまでの速度論的時間を、校正増殖曲線の10倍希釈系列に関連付けます。
生存細胞数の定量化は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（QPCR）と数学的に同一のプロセスを使用して行われますが、QGK細胞ではPCR産物のコピーではなく、指数関数的に増殖します。閾値に達するまでの時間は「閾値時間」Ttと呼ばれ、これはQPCR値の「サイクル時間」またはCtに相当します。
VCCアッセイにおける閾値時間の遅延を引き起こすプロセスは少なくとも5つ存在する。
VCCは当初、大腸菌、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、エンテロバクター・アエロゲネスの6株に対するペプチドの抗菌活性を定量するために使用されました。[ 1 ] 一般的に、標準的なグラム陰性菌とグラム陽性菌の品質管理株が比較されます。 大腸菌ATCC 25922と黄色ブドウ球菌ATCC 29213は、それぞれ標準的なグラム陰性菌とグラム陽性菌として使用されています。VCCは、炭疽病の原因菌である炭疽菌にも適用されています。[ 10 ] さらに、VCCはサルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム[ 11 ]とアシネトバクター・バウマニ[ 12 ]にも適用されています。
最初の仮想コロニーカウント研究では、6 つのヒトα ディフェンシン(HNP1、HNP2、HNP3、HNP4、HD5、HD6)の活性を同じ 96 ウェルプレートで同時に測定しました。[ 1 ] その後、これらの 6 つのディフェンシンの変異型が VCC によって研究されました。HNP2 のβ バルジにある保存されたグリシンが一連のD- アミノ酸に置き換えられ、その結果、VCC 活性は側鎖の疎水性と電荷に比例しました。[ 13 ] VCC は、N 末端アセチル化および/または C 末端アミド化された HNP2 活性が静電荷に比例することを示しました。 [ 14 ] VCCの結果は、一連の塩橋破壊変異体でも再び電荷に比例し、塩橋は HNP2 機能に必要ではないことを示唆しています。[ 15 ] VCC は、プロペプチドHNP1 の N 末端の天然および人工プロセグメントの重要性を測定し、大腸菌および黄色ブドウ球菌に対する活性を劇的に変化させました。[ 16 ] [ 17 ] D-アミノ酸のみで構成されるHNP1、HNP4、HD5、およびベータディフェンシン 2のエナンチオマー形態は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対するディフェンシン活性の異なるメカニズムを示唆しました。[ 18 ] HNP1 の二量体化が阻害されたモノマーおよびテザー二量体形態の VCC 結果は、二量体化 の重要性を示しました。[ 19 ] 保存されたグリシンを L-アラニンに置き換えると、微妙な VCC の違いが生じました。[ 20 ] HNP1 [ 21 ] [ 22 ]およびHD5 [ 23 ]の 包括的なアラニンスキャン変異誘発により、かさ高い疎水性残基の重要性が実証された。HD5のジスルフィド結合の減少はVCC活性を低下させたが、3つのグラム陰性菌株に対するリポ多糖結合活性を増強した。[ 11 ]ジスルフィド結合を1つ持つ、またはジスルフィド結合を持たないHD5変異体は、A. baumannii に対するVCC活性が大幅に低下した。一方、ジスルフィド還元とアルギニン導入によって構築されたHD5の単純化誘導体は、A. baumanniiの多剤耐性株に対して強力な活性を示した。[ 12 ]これらの研究は、追加のβディフェンシン、θディフェンシン、[ 10 ]およびヒトカテリシジンLL-37および関連ペプチド を含むように拡張されている。[ 2 ] マウスクリプトジンの研究の仮想コロニーカウントの結果は、クリプトジンによるE. coliの殺傷は、 S. aureusの殺傷に重要な三次構造および四次構造とは一般的に独立していることを示しており、これは2つの異なる作用機序を示唆している。[ 24 ]
接種菌量効果は、これまで多くの抗菌剤について報告されており、試験に細菌を多く加えると薬剤の効果が低下する。[ 25 ] この効果は、β-ラクタマーゼ産生菌に対して試験した場合、β-ラクタムでよく観察される。接種菌量効果は、従来のコロニー計数とVCCを並行して行ったHNP1、pro LL-37、LL-37の研究に関連している可能性がある。[ 2 ]その報告では、試験したすべてのペプチドと菌株について、従来のコロニー計数生存値が仮想生存値よりも低いことがわかった。VCCアッセイでは、使用した標準化された従来のコロニー計数プロトコルと比較して細菌の接種菌量が20倍多かったため、その差は接種菌量効果によるものと考えられるが、接種菌量が多いほど活性が高くなるため、他の抗菌剤で通常見られる接種菌量効果とは逆の効果となる。この可能性は、主にディフェンシンHNP1と細菌株E. coli、S. aureus、B. cereusに焦点を当てた一連のVCC実験で調査された。6つの実験の結果は、 E. coliに対するHNP1の顕著な接種効果を示した。[ 26 ]
仮想生存率と仮想致死量を計算するために使用される複雑なMicrosoft Excelスプレッドシートと、閾値時間を計算するために使用されるVisual Basicマクロが公開されています。[ 26 ] スプレッドシートとマクロはGitHubにも公開されています。[ 27 ]
VCC ユーザーは、上記の QGK 校正曲線や最初の VCC 出版物[ 1 ]で報告された校正曲線と同様に、10 マイクロリットルなどの少量の細胞を 90 マイクロリットルなどの大容量の細胞の下に移すよう注意されていますが、同じ論文でディフェンシン活性をテストするために使用された実験手順とは異なります。改良されたピペット操作法は、2011 年にバイオセーフティレベル 3 (BSL-3)病原体Bacillus anthracisの研究で説明されました。[ 10 ] 2005 年に発表された元の方法では、50 マイクロリットルの細胞懸濁液を 50 マイクロリットルの液体に移すものでしたが、細胞をリン酸緩衝液の下のウェルの底に直接移すと、泡、気泡、濁度が発生し、濁度測定法と相性が悪くなります。この問題を回避するために、細胞懸濁液を上から液滴として加えると、エアロゾルが発生し、交差汚染につながる可能性があります。[ 28 ]有害な細菌のバイオエアロゾルも安全上のリスクをもたらす可能性があり、バイオセーフティキャビネット内で実験を行うことでリスクを軽減できます。
この記事は、2019 年に外部の学術査読のためにWikiJournal of Scienceに投稿されました(査読者レポート)。更新されたコンテンツは、CC-BY-SA-3.0ライセンス ( 2021 年) の下で Wikipedia ページに再統合されました。査読された記録バージョンは次のとおりです。Bryan Ericksen; et al . (2020年2 月 16 日)。「仮想コロニー数」(PDF)。WikiJournal of Science。3 ( 1 ): 3。doi : 10.15347 /WJS/ 2020.003。ISSN 2470-6345。Wikidata Q86161728。