リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムPCR、または定量的に使用される場合はqPCR）は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく分子生物学の実験技術です。従来のPCRのようにPCRの最後にではなく、PCR中に（つまりリアルタイムで）標的DNA分子の増幅を監視します。リアルタイムPCRは定量的にも半定量的にも（つまり、DNA分子の一定量以上/以下で）使用できます。

リアルタイムPCRでPCR産物を検出する一般的な方法は2つあります。(1)任意の二本鎖DNAに挿入される非特異的蛍光色素と、(2)蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドで構成される配列特異的DNAプローブです。これにより、プローブとその相補配列との ハイブリダイゼーション後にのみ検出が可能になります。

定量的リアルタイムPCR実験の公表のための最小限の情報（MIQE）ガイドラインでは、定量的リアルタイムPCRには略語qPCRを使用し、逆転写qPCRにはRT-qPCRを使用することを提案している。^[1]頭字語「RT-PCR」は一般に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を示し、リアルタイムPCRを示すものではないが、すべての著者がこの慣例に従っているわけではない。^[2]

すべての生物の細胞は、遺伝子転写産物（一本鎖RNA ）のターンオーバーによって遺伝子発現を制御します。細胞内で発現した遺伝子の量は、サンプル中に存在するその遺伝子のRNA転写産物のコピー数によって測定できます。少量のRNAから遺伝子発現を確実に検出し定量化するには、遺伝子転写産物の増幅が必要です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNAを増幅するための一般的な方法です。RNAベースのPCRでは、まずRNAサンプルを逆転写酵素で相補DNA（cDNA）に逆転写します。

少量の DNA を増幅するために、従来の PCR と同じ方法論が使用され、DNA テンプレート、少なくとも 1 組の特定のプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、適切な緩衝液、および耐熱性 DNA ポリメラーゼが使用されます。蛍光体でマークされた物質が、必要な波長で励起された後の蛍光体を測定するセンサーを含むサーマルサイクラーでこの混合物に追加され、1 つまたは複数の特定の生成物の生成速度を測定できます。これにより、各 PCR サイクルで増幅された生成物の生成速度を測定できます。このようにして生成されたデータは、コンピューターソフトウェアで分析して、いくつかのサンプルでの相対的な遺伝子発現(またはmRNA コピー数) を計算できます。定量的 PCR は、サンプル内の DNA の検出と定量化にも適用でき、これらのサンプル内の特定の DNA 配列の存在と存在量を決定します。^[3]この測定は各増幅サイクルの後に行われるため、この方法はリアルタイム PCR (つまり、即時 PCR または同時 PCR) と呼ばれます。

定量PCRとDNAマイクロアレイは、遺伝子発現を研究するための現代的な方法論です。mRNAの存在量を測定するために、ディファレンシャルディスプレイ、RNase保護アッセイ、ノーザンブロットなどの古い方法が使用されていました。ノーザンブロットは、サンプル中のmRNA転写産物の豊富さを視覚化することで、遺伝子の発現レベルを推定するためによく使用されます。この方法では、精製されたRNAをアガロースゲル電気泳動で分離し、固体マトリックス（ナイロン膜など）に移し、目的の遺伝子に相補的な特定のDNAまたはRNAプローブで調べます。この技術は現在でも遺伝子発現の評価に使用されていますが、比較的大量のRNAが必要であり、mRNAレベルの定性的または半定量的な情報しか得られません。^{[4]定量方法の変動から生じる推定誤差は、DNAの完全性、}酵素効率、その他多くの要因の結果である可能性があります。このため、いくつかの標準化システム（正規化方法と呼ばれることが多い）が開発されました。総遺伝子発現を定量化するために開発されたものもあるが、最も一般的なものは、研究対象の特定の遺伝子を、ほぼ一定の発現レベルを持つように選択された正規化遺伝子と呼ばれる別の遺伝子との関係で定量化することを目的としています。これらの遺伝子は、基本的な細胞生存に関連する機能が通常構成的遺伝子発現を意味するため、ハウスキーピング遺伝子から選択されることがよくあります。^{[5] [6]}これにより、研究者は、選択した正規化遺伝子の発現で割った対象遺伝子の発現の比率を報告できるため、実際に絶対的な発現レベルを知らなくても、対象遺伝子を比較することができます。

最も一般的に使用される正常化遺伝子は、チューブリン、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、アルブミン、シクロフィリン、リボソームRNAなどの分子をコードする遺伝子である。^[4]

リアルタイム PCR は、各サンプルを少なくとも 1 つの特定の波長の光線で照射し、励起された蛍光体から放出される蛍光を検出する機能を備えたサーマルサイクラーで実行されます。サーマルサイクラーは、サンプルを急速に加熱および冷却することもできるため、核酸とDNA ポリメラーゼの物理化学的特性を活用できます。

PCR プロセスは、一般的に、25～50 回繰り返される一連の温度変化から構成されます。これらのサイクルは通常、3 つの段階から構成されます。最初の段階は、約 95 °C で、核酸の二重鎖を分離します。2 番目の段階は、約 50～60 °C で、プライマーと DNA テンプレートを結合します。 ^[7] 3 番目の段階は、68 ～ 72 °C で、DNA ポリメラーゼによる重合を促進します。断片のサイズが小さいため、このタイプの PCR では、アライメント段階と変性段階の間の変化中に酵素が DNAアンプリコンを複製できるため、最後のステップは通常省略されます。さらに、4 ステップ PCR では、非特異的な染料が使用される場合にプライマー ダイマーの存在によって発生する信号を減らすために、各サイクルで数秒しか続かない短い温度段階 (たとえば 80 °C) で蛍光が測定されます。^{[8]各サイクルで使用される温度とタイミングは、DNA合成に使用される酵素、反応中の二価イオンと}デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）の濃度、プライマーの結合温度など、さまざまなパラメータによって異なります。^[9]

リアルタイム PCR 技術は、PCR 産物の検出に使用される化学物質、特異的蛍光色素、非特異的蛍光色素によって分類できます。

DNA 結合色素は PCR 中のすべての二本鎖 (ds) DNAに結合し、色素の蛍光量子収率を高めます。したがって、PCR 中の DNA 産物の増加は、各サイクルで測定される蛍光強度の増加につながります。ただし、SYBR Greenなどの dsDNA 色素は、非特異的 PCR 産物 (プライマーダイマーなど) を含むすべての dsDNA PCR 産物に結合します。これにより、意図したターゲット配列の正確なモニタリングが妨げられるか、妨げられる可能性があります。

dsDNA 色素を使用したリアルタイム PCR では、蛍光 dsDNA 色素を加えて通常どおり反応を準備します。次に、リアルタイム PCR 装置で反応を実行し、各サイクルの後に検出器で蛍光の強度を測定します。色素は、dsDNA (PCR 産物) に結合した場合にのみ蛍光を発します。この方法の利点は、増幅を実行するためにプライマーのペアのみが必要なため、コストを抑えることができ、異なるタイプの色素を使用することで、チューブ内で複数のターゲット配列を監視できます。

蛍光レポータープローブは、プローブに相補的な配列を含む DNA のみを検出するため、レポータープローブを使用すると特異性が大幅に向上し、他の dsDNA が存在する場合でもこの手法を実行できます。異なる色のラベルを使用すると、蛍光プローブをマルチプレックスアッセイで使用して、同じチューブ内の複数のターゲット配列をモニタリングできます。蛍光レポータープローブの特異性により、PCR で望ましくない副産物となる可能性のあるプライマーダイマーによる測定の干渉も防止されます。ただし、蛍光レポータープローブはプライマーダイマーの阻害効果を防ぐことはできず、プライマーダイマーは反応中の目的の生成物の蓄積を抑制する可能性があります。

この方法は、片方の端に蛍光レポーター、もう一方の端に蛍光の消光剤を備えた DNA ベースのプローブを使用します。レポーターが消光剤に近接しているため、蛍光の検出が妨げられます。Taqポリメラーゼの 5' から 3' へのエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、レポーターと消光剤の近接性が崩れ、消光されない蛍光の放出が可能になり、レーザーで励起すると検出できます。したがって、各 PCR サイクルでレポーター プローブがターゲットとする生成物が増加すると、プローブの分解とレポーターの放出により、蛍光が比例して増加します。

1. PCR は通常どおりに準備され ( PCR を参照)、レポータープローブが追加されます。
2. 反応が始まると、 PCR のアニーリング段階でプローブとプライマーの両方が DNA ターゲットにアニーリングします。
3. 新しい DNA 鎖の重合はプライマーから開始され、ポリメラーゼがプローブに到達すると、5'-3'-エキソヌクレアーゼがプローブを分解し、蛍光レポーターとクエンチャーを物理的に分離して、蛍光が増加します。
4. リアルタイム PCR 装置で蛍光を検出して測定し、産物の指数関数的増加に対応する蛍光の幾何学的増加を使用して、各反応の定量サイクル(C _q )を決定します。

リアルタイムPCRは、特定の増幅DNA断片の融解温度（融解温度からTm値とも呼ばれる）の分析により、その断片を識別することを可能にする_。使用される方法は通常、二本鎖DNA結合色素をレポーターとして使用するPCRであり、使用される色素は通常SYBR Greenである。DNA融解温度は増幅断片に固有のものである。この技術の結果は、分析されたDNAサンプルの解離曲線を比較することによって得られる。^[11]

従来の PCR とは異なり、この方法では、すべてのサンプルの結果を示すために電気泳動技術を使用する必要がありません。これは、定量的 PCR は、速度論的技術であるにもかかわらず、通常は明確なエンドポイントで評価されるためです。したがって、この技術では、通常、電気泳動よりも迅速に結果が得られ、使用する反応物が少なくなります。その後に電気泳動が必要な場合は、リアルタイム PCR で疑わしいと判明したサンプルをテストするか、特定の決定因子に対して陽性と判定されたサンプルの結果を承認するだけで済みます。

エンドポイントPCR（従来のPCR）とは異なり、リアルタイムPCRでは、蛍光を測定することで増幅プロセスのどの時点でも目的の産物をモニタリングできます（リアルタイムフレームで、所定の閾値を超えるレベルが測定されます）。リアルタイムPCRによるDNA定量の一般的な方法は、対数スケールで蛍光をサイクル数に対してプロットすることです。DNAベースの蛍光を検出するための閾値は、バックグラウンドを超える信号ノイズの標準偏差の3～5倍に設定されます。蛍光が閾値を超えるサイクル数は、閾値サイクル（C _t）またはMIQEガイドラインに従って定量サイクル（C _q）と呼ばれます。^[1]

指数関数的増幅段階では、ターゲット DNA テンプレート (アンプリコン) の量はサイクルごとに 2 倍になります。たとえば、C _qが別のサンプルより 3 サイクル先行する DNA サンプルには、2 ³ = 8 倍のテンプレートが含まれています。ただし、増幅の効率はプライマーとテンプレートによって異なることがよくあります。そのため、プライマーとテンプレートの組み合わせの効率は、DNA テンプレートの連続希釈による滴定実験で評価され、各希釈での(C _q )の変化の標準曲線が作成されます。次に、線形回帰の傾きを使用して増幅の効率を決定します。1:2 の希釈で(C _q )の差が 1 になる場合は、増幅の効率は 100% です。サイクルしきい値法では、反応メカニズムについていくつかの仮定が立てられており、増幅プロファイルの低信号対雑音領域のデータに依存しているため、データ分析中に大きな変動が生じる可能性があります。^[12]

遺伝子発現を定量化するには、対象遺伝子のRNAまたはDNAの（C _q）を、同じサンプル内のハウスキーピング遺伝子のRNA/DNAの（C _q）から減算して、異なるサンプル間のRNAの量と品質の変動を正規化します。この正規化手順は一般にΔC _t法^[13]と呼ばれ、異なるサンプル間で対象遺伝子の発現を比較することができます。ただし、このような比較を行うには、正規化参照遺伝子の発現がすべてのサンプルで非常に類似している必要があります。したがって、この基準を満たす参照遺伝子を選択することは非常に重要であり、さまざまな条件や組織にわたって同等の発現レベルを示す遺伝子はごくわずかであるため、しばしば困難です。^{[14] [15]}サイクル閾値分析は多くの市販ソフトウェアシステムに統合されていますが、再現性が懸念される場合は、増幅プロファイルデータを分析するためのより正確で信頼性の高い方法を検討する必要があります。^[12]

メカニズムベースのqPCR定量法も提案されており、定量に標準曲線を必要としないという利点がある。MAK2 ^[16]などの方法は、標準曲線法と同等かそれ以上の定量性能を持つことが実証されている。これらのメカニズムベースの方法は、ポリメラーゼ増幅プロセスに関する知識を使用して、元のサンプル濃度の推定値を生成する。このアプローチの拡張には、PCR反応プロファイル全体の正確なモデルが含まれており、これにより、高い信号対雑音比のデータの使用と、分析前にデータ品質の検証が可能になります。^[12]

Ruijterらの研究^[17]によると、MAK2はPCR反応中の増幅効率が一定であると想定しています。しかし、MAK2の由来となったポリメラーゼ連鎖反応の理論的分析により、増幅効率はPCR全体を通じて一定ではないことが明らかになりました。MAK2定量は、通常のqPCR条件下ではサンプル中の標的DNA濃度の信頼性の高い推定値を提供しますが、競合計を使用したqPCRアッセイでは、MAK2は標的濃度を信頼性の高い方法で定量化できません。

定量的ポリメラーゼ連鎖反応は、研究室でさまざまな用途に使用されています。診断と基礎研究の両方で一般的に使用されています。産業界でのこの技術の用途には、食品や植物質の微生物負荷の定量、GMO（遺伝子組み換え生物）の検出、ヒトウイルス病原体の定量と遺伝子型判定などがあります。

従来のDNA検出法による遺伝子発現の定量は信頼性に欠ける。ノーザンブロット法によるmRNAの検出やゲルまたはサザンブロット法によるPCR産物の検出では、正確な定量は不可能である。^[18]例えば、典型的なPCRの20～40サイクルでは、DNA産物の量は最初のPCRにおける標的DNAの量と直接相関しないプラトーに達する。 ^[19]

リアルタイムPCRは、相対定量と絶対定量という2つの一般的な方法で核酸を定量するために使用できます。 ^{[20]絶対定量では、}検量線を使用してDNA標準と比較することにより、ターゲットDNA分子の正確な数が得られます。したがって、サンプルと標準のPCRが同じ増幅効率を持つことが不可欠です。^[21] 相対定量は、ターゲット遺伝子の発現の倍数差を決定するための内部参照遺伝子に基づいています。定量は、相補DNA（ mRNAの逆転写によって生成されたcDNA ）として解釈されるmRNAの発現レベルの変化として表されます。相対定量は、研究対象の遺伝子の量をコントロール参照遺伝子の量と比較するため、検量線を必要としないため、実行が簡単です。

相対定量の結果を表すために使用される単位は重要ではないため、結果はさまざまなRTqPCR間で比較できます。1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子を使用する理由は、使用されるRNAの量と品質の違いなど、逆転写の効率、ひいてはPCRプロセス全体の効率に影響を与える可能性のある非特異的な変動を修正するためです。ただし、このプロセスの最も重要な側面は、参照遺伝子が安定している必要があることです。^[22]

これらの参照遺伝子の選択は、伝統的に分子生物学において、 RNAゲルの視覚的検査、ノーザンブロットデンシトメトリー、または半定量PCR（PCRミミック）などの定性的または半定量的研究を用いて行われてきました。現在、ゲノム時代においては、トランスクリプトミクス技術を用いて多くの生物についてより詳細な推定を行うことが可能です。^[23]しかし、研究では、mRNAの発現を定量化するために使用される参照遺伝子の大部分の増幅は、実験条件によって異なることが示されています。^{[24] [25] [26]したがって、最も適切な参照遺伝子を選択するためには、最初に}統計的に健全な方法論的研究を行う必要があります。

特定の条件下でどの遺伝子が最も適しているかを検出できる統計アルゴリズムが数多く開発されています。geNORMやBestKeeperなどのアルゴリズムは、異なる参照遺伝子と組織のマトリックスのペアまたは幾何平均を比較できます。^{[4] [6]}

診断用定性PCRは、感染症、^{[27] [28]}がんや遺伝子異常などの診断に必要な核酸を迅速に検出するために使用されます。臨床微生物学研究室への定性PCRアッセイの導入により、感染症の診断が大幅に改善され、^[29]診断検査では、インフルエンザやコロナウイルスの新しい株など、新たに出現した疾患を検出するためのツールとして展開されています。^{[31] [32]}

定量PCRは、食品安全、食品腐敗、発酵の分野で働く微生物学者や、水質（飲料水やレクリエーション用水）の微生物リスク評価、公衆衛生保護にも使用されています。^[33]

qPCRは、環境サンプルから採取したDNA中の遺伝子の分類学的または機能的マーカーを増幅するためにも使用される。^[34]マーカーは、DNAの遺伝子断片または相補DNAによって表される。^[34]特定の遺伝要素を増幅することにより、増幅前のサンプル中の要素の量を定量化することができる。^[34]分類学的マーカー（リボソーム遺伝子）とqPCRを使用すると、サンプル中の微生物の量を決定するのに役立ち、マーカーの特異性に基づいて異なる科、属、または種を識別することができる。^[34]機能的マーカー（タンパク質コード遺伝子）を使用すると、コミュニティ内の遺伝子発現を示すことができ、環境に関する情報が明らかになる可能性がある。^[34]

農業業界は、経済的損失を防ぎ、健康を守るために、病原体のない植物の繁殖体や苗木を生産しようと絶えず努力しています。オークなどの種を枯らす卵菌類であるフィトフトラ・ラモルムのDNAが宿主植物のDNAに混ざっている場合でも、それを検出できるシステムが開発されました。病原体と植物のDNAの識別は、ITS配列（リボソームRNA遺伝子のコーディング領域にあるスペーサーで、各分類群に特徴的な配列）の増幅に基づいています。^[35]この技術のフィールド版も、同じ病原体を特定するために開発されました。^[36]

逆転写を用いたqPCR（RT-qPCR）は、DNA検出の感度とダイナミックレンジを考えると、GMOの検出に使用できます。DNAやタンパク質分析などの代替手段は通常、感度が低くなります。トランスジェニック遺伝子ではなく、プロモーター、ターミネーター、またはベクターの設計プロセス中に使用される中間配列を増幅する特定のプライマーが使用されます。トランスジェニック植物を作成するプロセスでは通常、トランスジェニック遺伝子のコピーが複数挿入されるため、その量も一般的に評価されます。これは、処理された種から1つのコピーとしてのみ存在するコントロール遺伝子を使用して相対定量化によって実行されることがよくあります。^{[37] [38]}

ウイルスは直接感染または共感染によってヒトに存在する可能性があり、古典的な技術では診断が困難で、誤った予後や治療につながる可能性があります。qPCRを使用すると、B型肝炎ウイルスなどのウイルスの定量と遺伝子型判定（融解曲線を使用して行われる株の特性評価）の両方が可能になります。^[39]感染の程度は、患者の組織1単位あたりのウイルスゲノムのコピーとして定量化され、多くの場合関連しています。たとえば、1型単純ヘルペスウイルスが再活性化する確率は、神経節内の感染したニューロンの数に関連しています。^[40]この定量化は、逆転写の有無にかかわらず実行されます。逆転写は、ウイルスがサイクルのどの時点でもヒトゲノムに組み込まれた場合に発生します。HPV（ヒトパピローマウイルス）の場合に発生するように、 HPVの変異体の一部は子宮頸がんの出現に関連しています。^[41] リアルタイムPCRは、固形臓器や骨髄移植後に免疫抑制状態にある患者に見られるヒトサイトメガロウイルス（CMV）の定量化ももたらした。 ^[42]

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