二光子励起顕微鏡

二光子励起顕微鏡（TPEFまたは2PEF）は、厚さ約1ミリメートルまでの散乱性生体組織の画像化に特に適した蛍光イメージング技術です。励起波長が発光波長よりも短い従来の蛍光顕微鏡とは異なり、二光子励起では、発光よりも波長の長い2つの光子による同時励起が必要です。レーザーは組織内の特定の位置に集光され、サンプル全体を走査して順次画像を生成します。二光子励起の非線形性により、主にレーザービームのマイクロメートルサイズの焦点にある蛍光体が励起され、これが画像の空間分解能を生み出します。これは、励起焦点とピンホールによる限定検出との相互作用によって空間分解能が生成される共焦点顕微鏡とは対照的です。

二光子励起顕微鏡では、通常、蛍光色素も励起できる近赤外線（NIR）励起光を使用します。赤外線は一般的な生体組織では散乱が少ないため、赤外線を使用すると組織内での散乱が最小限に抑えられます。多光子吸収により、バックグラウンド信号が強く抑制されます。これらの効果により、この技術の浸透深度が増加します。二光子励起は、より深い組織浸透、効率的な光検出、および光退色の低減により、共焦点顕微鏡よりも優れた代替手段となり得ます。^{[ 2 ] [ 3 ]}

二光子励起は二光子吸収を利用するもので、この概念はマリア・ゲッパート・マイヤー（1906～1972）が1931年の博士論文で初めて記述し^{[ 4 ]}、1961年にヴォルフガング・カイザーがレーザー励起を用いて_CaF2 :Eu2 ⁺結晶で初めて観測した^{[ 5 ]}。アイザック・アベラは1962年にセシウム蒸気で単一原子の二光子励起が可能であることを示した^{[ 6 ] 。}

二光子励起蛍光顕微鏡は、レーザー走査型共焦点顕微鏡やラマン顕微鏡などの他の共焦点レーザー顕微鏡技術と類似点があります。これらの技術は、集束されたレーザービームをラスタースキャン方式で走査して画像を生成するため、どちらも光学的断層撮影効果があります。共焦点顕微鏡とは異なり、多光子顕微鏡には、共焦点顕微鏡の光学的断層撮影特性を生み出すピンホール開口部がありません。多光子顕微鏡によって生じる光学的断層撮影は、励起光の点像分布関数によって実現されます。

二光子励起の概念は、一光子励起に必要なエネルギーよりも比較的低い光子エネルギーを持つ二光子でも、一つの量子イベントで蛍光体を励起できるという考えに基づいています。各光子は、分子を励起するために必要なエネルギーの約半分を運びます。放出される光子は、励起に使用された二光子のどちらよりも高いエネルギー（短い波長）を持ちます。二光子がほぼ同時に吸収される確率は極めて低いため、通常はフェムト秒パルスレーザーによって生成される、高いピーク励起光子束が必要となります。例えば、同じ平均レーザー出力でもパルス化しない場合、二光子効果によってパルスレーザーで生成される蛍光と比べて、検出可能な蛍光は得られません。

多光子顕微鏡で使用される、波長が長くエネルギーが低い（一般的には赤外線）励起レーザーは、単光子励起に一般的に使用される短波長レーザーよりも損傷が少ないため、生細胞のイメージングに適しています。そのため、生体組織をより長い時間観察しても、毒性の影響は少なくなります。

最も一般的に使用される蛍光色素の励起スペクトルは400 ～ 500  nmの範囲にありますが、二光子蛍光を励起するために使用されるレーザーは、Tiサファイアレーザーによって生成される約700 ～ 1100  nm（赤外線）の範囲にあります。蛍光色素が2つの赤外線光子を同時に吸収すると、励起状態になるのに十分なエネルギーを吸収します。その後、蛍光色素は、使用する蛍光色素の種類に応じて波長が変化する（通常は可視光スペクトル）単一の光子を放出します。蛍光色素の励起中に2つの光子が吸収されるため、蛍光色素からの蛍光放出の確率は励起強度の2乗に比例して増加します。したがって、レーザービームが強く集束されている場所では、拡散している場所よりもはるかに多くの二光子蛍光が生成されます。事実上、励起は微小な焦点体積（約1フェムトリットル）に限定されるため、焦点外の物体は高度に除去されます。この励起の局在化は、ピンホールなどの要素を用いて焦点外の蛍光を除去する必要がある単一光子励起顕微鏡と比較して、重要な利点となります。試料からの蛍光は、光電子増倍管などの高感度検出器によって収集されます。この観測された光強度が最終的な画像の1ピクセルとなり、焦点位置を試料の目的領域全体に走査することで、画像のすべてのピクセルが形成されます。

二光子顕微鏡は、 1990 年にコーネル大学のワット W. ウェッブの研究室でウィンフリート デンクとジェームズ ストリックラーによって開拓され、特許を取得しました。彼らは二光子吸収のアイデアとレーザー スキャナーの使用を組み合わせました。^{[ 2 ] [ 7 ]}二光子励起顕微鏡では、赤外線レーザー ビームが対物レンズを通して集束されます。通常使用されるTi-サファイア レーザーは、パルス幅が約 100 フェムト秒 (fs)、繰り返し周波数が約 80 MHzであり、二光子吸収に必要な高い光子密度とフラックスを実現し、広範囲の波長で調整可能です。 

光散乱組織中の蛍光色素を励起するために赤外光を使用することには、追加の利点があります。^{[ 8 ]}波長が長いほど散乱の度合いが低くなるため、高解像度イメージングに有利です。さらに、これらの低エネルギー光子は焦点体積外に損傷を与える可能性が低くなります。共焦点顕微鏡と比較すると、散乱光子でさえ使用可能な信号に寄与するため、光子検出ははるかに効果的です。散乱組織でのイメージングにおけるこれらの利点は、2光子励起顕微鏡の発明から数年後にようやく認識されました。^{[ 9 ]}

二光子顕微鏡を使用する際には、いくつかの注意点があります。二光子励起に必要なパルスレーザーは、共焦点顕微鏡で使用される連続波（CW）レーザーよりもはるかに高価です。分子の二光子吸収スペクトルは、一光子吸収スペクトルとは大きく異なる場合があります。高次光損傷が問題となり、光退色はレーザー出力の二乗に比例しますが、単光子（共焦点）顕微鏡では線形です。単離細胞などの非常に薄い物体の場合、励起波長が短いため、単光子（共焦点）顕微鏡の方が光学解像度の高い画像が得られます。一方、散乱組織では、二光子顕微鏡の優れた光学的断層撮影能力と光検出能力により、より優れた性能が得られます。

Simultaneous absorption of three or more photons is also possible, allowing for higher-order multiphoton excitation microscopy.^[33] So-called "three-photon excitation fluorescence microscopy" (3PEF) is the most used technique after 2PEF, to which it is complementary. Localized isomerization of photoswitchable drugs in vivo using three-photon excitation has also been reported.^[34]

In general, all commonly used fluorescent proteins (CFP, GFP, YFP, RFP) and dyes can be excited in two-photon mode. Two-photon excitation spectra are often considerably broader, making it more difficult to excite fluorophores selectively by switching excitation wavelengths.

極めて高い2光子吸収断面積を持つ、緑色、赤色、および近赤外線発光色素（プローブおよび反応性ラベル）がいくつか報告されている。^{[ 35 ]}ドナー-アクセプター-ドナー型の構造により、Seta-670、Seta-700、Seta-660などのスクアライン色素は、他の色素と比較して非常に高い2光子吸収（2PA）効率を示す。^{[ 35 ] [ 36 ] [ 37 ]}新しいタイプのスクアラインロタキサンであるSeTau-647およびSeTau-665は、近赤外線領域で最大10,000 GMという極めて高い2光子作用断面積を示し、他のどのクラスの有機色素にも勝る。^{[ 35 ]}

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• 非線形光学
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• 二光子光電子分光法
• 広視野多光子顕微鏡

• シュミット、マイケル。マイヤーヘーファー、トーマス;ポップ、ユルゲン。クレッペ、インゴ。ヴァイシャート、クラウス (2013)。 「光と物質の相互作用」。バイオフォトニクスのハンドブック。土井：10.1002/9783527643981.bphot003。ISBN 978-3-527-64398-1. S2CID 93908151 . 
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• Yu, Hanry; Rahim, Nur Aida Abdul (2013).細胞および組織工学におけるイメージング. CRC Press. ISBN 978-1-4398-4804-3。

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• ウェビナー：シンプルでコスト効率の良い2光子顕微鏡のセットアップ
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• 二光子蛍光顕微鏡法、生命科学百科事典
• 「多光子蛍光顕微鏡」 .顕微鏡入門. フロリダ州立大学. 2018年3月3日取得.
• 多光子励起蛍光顕微鏡。ウィスコンシン大学。
• 多光子励起顕微鏡の基礎と応用。ニコン顕微鏡U。
• 「二光子作用断面積」
• 「二光子吸収（2PA）スペクトルデータベース」。KBFI 。