広視野多光子顕微鏡

広視野多光子顕微鏡法^{[2] [3] [4] [5]は}、スキャンを必要とせずに物体の広い領域を照射して画像化する超高速画像化に適した光学非線形画像化技術を指します。2光子蛍光や第二高調波発生などの非線形光学プロセスを誘発するには、高い強度が必要です。走査型多光子顕微鏡では、光をしっかりと焦点を合わせることで高い強度が達成され、ビームスキャンによって画像が得られます。広視野多光子顕微鏡法では、光学的に増幅されたパルスレーザー光源を使用して広い視野（約100 μm）を達成することで、高い強度が最もよく得られます。 ^{[2] [3] [4]この場合の画像は、スキャンを必要とせずにCCDで単一フレームとして取得されるため、対象物体全体の動的プロセスを同時に視覚化するのに特に役立ちます。広視野多光子顕微鏡法では、}多光子走査型顕微鏡法と比較してフレームレートを最大1000倍に増やすことができます。^[3]広視野多光子顕微鏡はまだ市販されていないが、いくつかの光学研究所に実用的なプロトタイプが存在している。

この技術の主な特徴は、パルスレーザービームでサンプル上の広い領域を照射することである。非線形光学では、パルスビームによって生成される非線形光子の量（N）は、1秒間に（照射）領域あたりで、次の式に比例する。^{[6] [7]}

${\displaystyle N\varpropto {\frac {E^{2}}{\tau A}}f}$、

ここで、E はビームのエネルギー（ジュール）、τ はパルスの持続時間（秒）、A は照射面積（平方メートル）、f はパルスビームの繰り返し率（ヘルツ）です。照射面積を増やすと、エネルギーを増やしない限り、生成される非線形光子の量は減ります。光による損傷はエネルギー密度、つまり面積あたりのピーク強度 I _p =E/(τA) に依存します。したがって、面積あたりのピーク強度を低く保てば、光学的損傷のリスクなしに面積とエネルギーの両方を簡単に増やすことができますが、二次依存性のため、生成される非線形光子の量を増やすことができます。たとえば、面積とエネルギーの両方を 1000 倍に増やすと、ピーク強度は変わりませんが、生成される非線形光子は 1000 倍に増えます。この 1000 個の余分な光子は、確かにより広い面積で生成されます。画像化では、余分な 1000 個の光子が画像全体に広がることを意味し、一見、多光子走査顕微鏡に比べて利点があるようには思えないかもしれません。しかし、画像のサイズとスキャン時間を考慮すると、その利点は明らかになります。^[3]走査型多光子顕微鏡と比較した広視野多光子顕微鏡によって生成される1秒あたりの画像フレームあたりの非線形光子の量は、^{[3]で与えられます。}

${\displaystyle {\frac {N_{\mathrm {広視野} }}{N_{\mathrm {スキャン} }}}=n{\frac {f_{\mathrm {広視野} }}{f_{\ mathrm {スキャン中} }}}}$、

両方のシステムで同じピーク強度が使用されていると仮定します。ここで、n は、 となるスキャンポイントの数です。 ${\textstyle A_{\mathrm {ワイドフィールド} }=nA_{\mathrm {スキャン} }}$

• この技術は、深度が増すにつれて画質が急速に低下するため、散乱組織（脳など）の深部を画像化するのに適していない。
• エネルギーをどこまで増加できるかはレーザー システムによって異なります。再生増幅器などの光増幅器は、通常、発振器ベースのシステム (例: Ti:サファイア レーザー)と比較して、低い繰り返し率で最大 mJ のエネルギーを生成できます。
• ビームが光学系のどこかで何らかの理由で狭い領域に集中すると、光学系が損傷する可能性があります。光学系を損傷するリスクを負わずに必要な照明を実現するには、さまざまな方法があります (「方法」を参照)。
• 深さ方向の断面が欠落している可能性があります。

• 超高速イメージング。1 つの画像を生成するには、1 回のレーザー ショットが必要です。したがって、フレーム レートは、レーザー システムの繰り返しレートまたは CCD カメラのフレーム レートに制限されます。
• 細胞へのダメージが少ない。水性システム（細胞など）では、中～低繰り返し周波数（1～200kHz）では照射パルス間で熱拡散が起こるため、高繰り返し周波数（80MHz）よりもダメージ閾値が高くなります。^{[8] [9]}
• 広視野照明により対象物全体を同時に観察できます。
• 必要な波長が長いため、1 光子蛍光に比べて生物学的イメージングにおける浸透深度が大きくなります。
• 広視野1光子蛍光顕微鏡よりも高い解像度。光学解像度は多光子走査顕微鏡と同等かそれ以上です[]。

結像光学系を破壊せずに広い照射領域を実現するのは技術的に困難である。1 つのアプローチは、いわゆる時空間集束^{[4] [5]}であり、パルスビームは回折格子によって空間的に分散され、「レインボー」ビームを形成し、その後、対物レンズによって集束される。^[5]回折格子を結像しながら「レインボー」ビームを集束させる効果により、異なる波長が対物レンズの焦点面で重なり合う。空間的または時間的な分散がそれ以上導入されなければ、異なる波長は重なり合う部分でのみ干渉するため、強力なパルス照明が取り出され、断面画像が得られる。軸方向の解像度は、構造化照明技術を使用しても、通常 2～3 μm ^{[4] [5]である。 [10] [11]}回折格子によって生成される空間分散により、レーザーのエネルギーが対物レンズのより広い領域に広がるため、レンズ自体が損傷する可能性が低くなる。

当初考えられていたこととは対照的に、時間的フォーカスは散乱に対して非常に堅牢です。^[12]最小限のスペックルで濁った媒体を透過する能力はオプトジェネティクスで使用され、組織を通して任意の光パターンを光励起することが可能になりました。^[12]時間的フォーカスは後に単一ピクセル検出と組み合わされ、蛍光光子に対する散乱の影響を克服しました。^[13]この技術はTRAFIXと呼ばれ、標準的な点走査型2光子顕微鏡よりも高い信号対背景比と低い光退色で、深いところにある生物組織を透過した広視野イメージングを可能にしました。^[13]

もう一つのより簡単な方法は、2本のビームを緩く焦点を合わせてサンプル上の領域（約100μm）に重ね合わせるというものです。^{[2] [3]}この方法では、各ビームの偏光を個別に変更できるため、テンソル のすべての要素にアクセスできます。${\displaystyle \chi^{(2)}}$