第二高調波イメージング顕微鏡

第二高調波イメージング顕微鏡法（SHIM）は、第二高調波発生（SHG）として知られる非線形光学効果に基づいています。SHIMは、細胞や組織の構造と機能を視覚化するための実用的な顕微鏡イメージングコントラストメカニズムとして確立されています。 ^[1] 第二高調波顕微鏡は、入射光から第二高調波光を生成する標本の能力の変化からコントラストを取得しますが、従来の光学顕微鏡は、標本の光学密度、経路長、または屈折率の変化を検出することでコントラストを取得します。SHGには、非中心対称分子構造を持つ材料を通過する強力なレーザー光が必要です。この分子構造は、固有のものであるか、たとえば電場によって外部から誘導されます。^[2]

SHG 材料から発生する第二高調波光は、材料に入る光の波長のちょうど半分（周波数が 2 倍）です。2光子励起蛍光(TPEF) も 2 光子プロセスですが、TPEF は励起状態の緩和中にいくらかのエネルギーを失いますが、SHG はエネルギーを保存します。通常、SHG 光を生成するには、ニオブ酸リチウム(LiNbO ₃ )、リン酸チタン酸カリウム(KTP = KTiOPO ₄ )、三ホウ酸リチウム(LBO = LiB ₃ O ₅ ) などの無機結晶が使用されます。SHG では、入射光を周波数 2 倍にするために材料が特定の分子配向を持っている必要がありますが、一部の生物学的材料は高度に分極化されており、かなり整然とした大きな非中心対称構造に組み立てられます。コラーゲン、微小管、筋肉ミオシン^[3]などの一部の生物学的材料はSHG信号を生成できますが、水でさえも特定の条件下では秩序化して第二高調波信号を生成することができ、これによりSH顕微鏡は分子を標識することなく表面電位を画像化できます。^[2] SHGパターンは主に位相整合条件によって決まります。SHGイメージングシステムの一般的なセットアップには、励起源としてチタンサファイアモードロックレーザーを備えたレーザー走査顕微鏡が含まれます。SHG信号は順方向に伝播します。ただし、いくつかの実験では、SHGによって生成された信号の波長の約10分の1のオーダーの物体は、ほぼ等しい順方向信号と逆方向信号を生成することが示されています。

SHIM は、生細胞や組織の画像化にいくつかの利点を提供します。SHG は、蛍光顕微鏡などの他の技術のように分子の励起を伴わないため、分子は光毒性や光退色の影響を受けないはずです。また、多くの生物学的構造が強力な SHG 信号を生成するため、生物学的システムの機能を変える可能性のある外因性プローブによる分子の標識付けは不要です。入射光に近赤外線波長を使用することで、SHIM は厚い組織のより深いところまで画像化して標本の3 次元画像を構築できます。

2光子蛍光（2PEF ）はSHGとは非常に異なるプロセスです。電子をより高いエネルギーレベルに励起し、その後光子放出によって脱励起します（これも2光子プロセスですが、SHGとは異なります）。したがって、2PEFは空間的（等方的に放出される）および時間的（サンプルに依存する広いスペクトル）に非コヒーレントなプロセスです。また、SHGとは異なり、特定の構造に固有のものではありません。^[4]

そのため、多光子イメージングにおいてSHGと組み合わせることで、組織内のエラスチンのような自己蛍光を発する分子を明らかにすることができます（一方、SHGはコラーゲンやミオシンなどを明らかにします）。^[4]

SHGがイメージングに使用される前、1961年にミシガン大学アナーバー校のPA Franken、G. Weinreich、CW Peters、およびAE Hillによって、石英サンプルを使用してSHGの最初のデモンストレーションが行われました。^[5] 1968年に、界面からのSHGがBloembergenによって発見され^[6]、それ以来、表面の特性評価や界面ダイナミクスの調査のためのツールとして使用されてきました。 1971年に、FineとHansenは、生物組織サンプルからのSHGの最初の観察を報告しました。^{[7] 1974年に、HellwarthとChristensenは、多結晶}ZnSe からのSHG信号をイメージングすることにより、SHGと顕微鏡法の統合を初めて報告しました。^[8] 1977年に、Colin Sheppardは、走査型光学顕微鏡でさまざまなSHG結晶をイメージングしました。 最初の生物学的イメージング実験は、1986年にFreundとDeutschによって、ラットの尾の腱のコラーゲン繊維の配向を研究するために行われました。^{[9] 1993年、ルイスは}電界中のスチリル染料 の第二高調波応答を調べた。また、生細胞をイメージングする研究も発表した。2006年、水谷五郎グループは、1996年に発表された2光子広視野顕微鏡^[10]を使用してSHGを検出できたにもかかわらず、大きなサンプルの観察に必要な時間を大幅に短縮する非走査型SHG顕微鏡を開発しました。非走査型SHG顕微鏡は、植物デンプン、^{[11] [12]}巨大分子、^[13]クモの糸^{[14] [15]}などの観察に使用されました 。2010年に、SHGは動物全体の生体内イメージングに拡張されました。^{[16] [17]} 2019年には、農薬の有効性を評価する方法を提供するために、葉の表面で直接農薬を選択的にイメージングする用途に適用され、SHGの用途が広がりました。^[18]

SHG信号は明確に定義された偏光を持っているため、 SHG偏光 異方性は組織内のタンパク質の配向と組織化の程度を決定するために使用できます。異方性方程式を使用すると：^[19]

${\displaystyle {\frac {I_{par}-I_{perp}}{I_{par}+2I_{perp}}}=r}$

平行方向と垂直方向の偏光の強度を取得します。値が高い場合は異方性配向を示し、値が低い場合は等方性構造を示します。CampagnolaとLoewによる研究^[19]では、コラーゲン繊維が値を持つよく整列した構造を形成することがわかりました。 ${\displaystyle r}$${\displaystyle r}$${\displaystyle r=0.7}$

SHG はコヒーレントなプロセス (空間的および時間的)であるため、励起の方向に関する情報を保持し、等方的に放射されません。主に前方方向 (励起と同じ) に放射されますが、位相整合条件に応じて後方方向に放射されることもあります。実際、信号の変換が減少するコヒーレンス長は次のとおりです。

${\displaystyle l_{c}=2/\デルタ k}$

で、前方では ですが、後方では>>となります。したがって、より厚い構造は前方に優先的に現れ、より薄い構造は後方に優先的に現れます。SHG 変換は最初の近似では非線形変換器の数の 2 乗に依存するため、厚い構造によって放射された場合は信号が高くなり、したがって前方方向の信号は後方方向よりも高くなります。ただし、組織は生成された光を散乱することがあり、前方の SHG の一部が後方方向に再帰反射される可能性があります。^[20] 次に、前方対後方比 F/B を計算します。^[20]は、SHG 変換器 (通常はコラーゲン原線維) の全体的なサイズと配置の測定基準です。散乱体の面外角度が大きいほど、F/B 比が高くなることもまた示されています ( ^[21]の図 2.14 を参照)。 ${\displaystyle \Delta k\propto 1/(n_{2\omega }-n_{\omega })}$${\displaystyle \Delta k_{bwd}\propto 1/(n_{2\omega }+n_{\omega })}$${\displaystyle l_{c}}$${\displaystyle l_{c,bwd}}$

偏光測定法の利点は、2002年にストーラーらによってSHGと結び付けられました。^[22]偏光測定法は分子レベルでの配向と秩序を測定でき、SHGと組み合わせることでコラーゲンなどの特定の構造に特異性を持たせることができます。偏光分解SHG顕微鏡法（p-SHG）は、SHG顕微鏡法の拡張版です。^[23] p-SHGは別の異方性パラメータを定義します。^[24]

${\displaystyle \rho ={\sqrt {\frac {I_{par}}{I_{perp}}}}}$

これはrと同様に、画像化される構造の主な配向と無秩序性の尺度です。この方法は長い円筒状のフィラメント（コラーゲンなど）で行われることが多いため、この異方性は に等しいことがよくあります [ ^25]。ここで は非線形感受率テンソル、X はフィラメントの方向（または構造の主方向）、Y は X に直交し、Z は励起光の伝播です。画像の XY 平面におけるフィラメントの配向ϕ は、 FFT 解析によって p-SHG から抽出し、マップに配置できます。^{[25] [26]}${\displaystyle \rho ={\frac {\chi _{XXX}^{(2)}}{\chi _{XYY}^{(2)}}}}$${\displaystyle \chi^{(2)}}$

コラーゲン（特殊なケースですが、SHG顕微鏡で広く研究されています）は、さまざまな形で存在することができます。28種類の異なるタイプがあり、そのうち5種類は線維状です。課題の1つは、組織内の線維状コラーゲンの量を特定して定量化し、その進化と他の非コラーゲン性物質との関係を確認することです。^[27]

そのためには、SHG顕微鏡画像を補正して、SHG波長に存在する少量の残留蛍光やノイズを除去する必要があります。その後、マスクを適用して画像内のコラーゲンを定量化することができます。^[27]他の量子化技術の中でも、これは非常に複雑であるにもかかわらず、おそらく最も高い特異性、再現性、適用性を備えた技術です。^[27]

また、この技術は、逆伝播する活動電位が電圧減衰なしに樹状突起棘に侵入することを証明するためにも使用されており、長期増強に関する将来の研究の確固たる基盤を確立しています。ここでのこの技術の使用は、標準的な2光子顕微鏡では達成できない精度で、小さな樹状突起棘の電圧を正確に測定する方法を提供したことです。 ^[28]一方、SHGは近赤外光を可視光に効率的に変換し、画像誘導光線力学療法を可能にし、浸透深度の制限を克服します。^[29]

SHG 顕微鏡法とその拡張は、さまざまな組織の研究に使用できます。いくつかのサンプル画像が下の図に示されています。細胞外マトリックス内のコラーゲンが主な用途です。腱、皮膚、骨、角膜、大動脈、筋膜、軟骨、半月板、椎間板などに見られます...

ミオシンは骨格筋や心筋でも画像化できます。

第三高調波発生（THG）顕微鏡は、横方向の界面と第3次の非線形感受率に敏感であるため、SHG顕微鏡を補完することができます^{[35] [36]}${\displaystyle \chi^{(3)}}$

マンモグラフィの密度はコラーゲン密度と相関関係にあるため、SHGは乳がんの特定に使用できます。^{[37] SHGは通常、}コヒーレント反ストークスラマン散乱や2光子励起顕微鏡などの他の非線形技術と組み合わせて、癌の可能性がある生検の非侵襲的で迅速な生体内組織学を提供する多光子顕微鏡（またはトモグラフィー）と呼ばれるルーチンの一部として使用されます。^[38]

前方および後方SHG画像の比較により、コラーゲンの微細構造についての洞察が得られ、それ自体が腫瘍のグレードとステージ、および乳房における腫瘍の進行に関連しています。^[39] SHGと2PEFの比較により、腫瘍内のコラーゲンの配向の変化も示されます。^[40] SHG顕微鏡検査は乳がん研究に大きく貢献していますが、病院での信頼できる技術として、またはこの病理の一般的な診断としてはまだ確立されていません。^[39]

健康な卵巣はSHGで均一な上皮層と間質内に整然としたコラーゲンを示すのに対し、異常な卵巣は大きな細胞と変化したコラーゲン構造を持つ上皮を示す。^[39] r比（「配向異方性」を参照）も使用され^[41]、癌組織では原線維の配列が正常組織よりもわずかに高いことを示す。

SHG は再び2PEFと組み合わされ、比率を計算するために使用されます。

${\displaystyle MFSI=({\text{shg}}-{\text{tpef}})/({\text{shg}}+{\text{tpef}})}$

ここでshg（またはtpef）はSHG（または2PEF）画像内の閾値ピクセル数であり、^[42] MFSIが高いということは純粋なSHG画像（蛍光なし）を意味します。最も高いMFSIは癌組織で見られ、^[39]正常組織と区別するためのコントラストモードを提供します。

SHGは第三高調波発生（THG）とも組み合わせられ、後方THG （「前方SHGと後方SHGの比較」を参照）が腫瘍内でより高いことが示されました。 ^[43]

膵臓癌におけるコラーゲンの超構造の変化は、多光子蛍光と偏光分解SHIMによって調べることができる。^[44]

SHG顕微鏡検査は肺癌、結腸癌、食道間質癌、子宮頸癌の研究に報告されている。^[39]

コラーゲン原線維の組織や極性の変化は病理の兆候となる可能性がある。^{[45] [46]}

特に、コラーゲン繊維の異方性配列により、皮膚の健康な真皮と病的な瘢痕を区別することが可能になりました。^[47]また、変形性関節症などの軟骨の病理は、偏光分解SHG顕微鏡で調べることができます。^{[48] [49] SHIMは後に線維軟骨（}半月板）にまで拡張されました。^[50]

SHGは特定の分子を画像化できるため、顕微鏡を使用して、特定の組織の構造を 1 つの材料ごとに、さまざまなスケール (マクロからミクロまで) で明らかにすることができます。たとえば、コラーゲン(タイプ I) は、細胞の細胞外マトリックス(ECM) から、または組織内で足場または結合材料として機能しているときに、具体的に画像化されます。^[51] SHG は、絹のフィブロイン、筋肉のミオシン、生合成セルロースも明らかにします。このすべての画像化機能は、組織の特定のポイントをターゲットにして、人工組織を設計するために使用できます。SHG は確かに、いくつかの方向、材料の量と配置を定量的に測定できます。^[51]また、他の多光子技術と組み合わせた SHG は、サンプルが比較的薄い場合でも、人工組織の開発を監視できます。^[52]もちろん、最終的には製造された組織の品質管理として使用できます。^[52]

目の表面にある角膜は、十分に密度の高いコラーゲンの自己組織化特性により、コラーゲンの合板のような構造でできていると考えられています。^{[53]しかし、この}組織におけるラメラのコラーゲン配向は依然として議論の的となっています。^[54]円錐角膜の角膜も、コラーゲンの形態学的変化を明らかにするために SHG で画像化することができます。^{[55]さらに、}角膜の画像化には第三高調波発生(THG) 顕微鏡が使用され、この組織における THG と SHG の最大値は異なる場所にあることが多いため、これは SHG 信号と相補的です。^[56]

• 非線形光学
• 第二高調波発生
• 二光子励起顕微鏡

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