三光子顕微鏡

三光子顕微鏡法（3PEF ）は、非線形励起効果に基づく高解像度の蛍光顕微鏡法である。 ^{[1] [2] [3]}二光子励起顕微鏡法とは異なり、三個の励起光子を使用する。通常、1300 nm以上の波長のレーザーを使用して、同時に吸収された三個の光子で蛍光色素を励起する。次に、蛍光色素は、各入射光子の3倍のエネルギー（よりわずかに小さい）の光子を1つ放出する。二光子顕微鏡法と比較して、三光子顕微鏡法は焦点面から蛍光を だけ減らし、これは二光子顕微鏡法の だけよりもはるかに速い。^[4] さらに、三光子顕微鏡法は、組織散乱効果の少ない近赤外光を使用する。これにより、三光子顕微鏡法は従来の顕微鏡法よりも解像度が高くなります。 ${\displaystyle 1/z^{4}}$${\displaystyle 1/z^{2}}$

三光子励起蛍光は、1964年にシンとブラッドリーがナフタレン結晶の三光子吸収断面積を推定した際に初めて観察されました。 ^[5] 1996年にステファン・W・ヘルは、三光子励起を走査型蛍光顕微鏡に適用する可能性を検証するための実験を設計し、三光子励起蛍光の概念をさらに証明しました。^[6]

3 光子顕微鏡法は、2 光子励起顕微鏡法といくつかの類似点があります。どちらもポイントスキャン方式を採用しています。どちらも、軸方向と横方向に沿ってフォーカスレンズの位置を調整することで、3D サンプルを画像化できます。両方のシステムの構造では、焦点外の光を遮断するピンホールは必要ありません。ただし、3 光子顕微鏡法は、点像分布関数、解像度、浸透深度、焦点外の光に対する耐性、および光退色の強さにおいて、 2 光子励起顕微鏡法とは異なります。

3光子励起では、蛍光体がほぼ同時に3つの光子を吸収します。3光子顕微鏡での励起レーザーの波長は約1200 nm以上で、発光波長は励起波長の3分の1よりわずかに長くなります。3光子顕微鏡は、励起波長が長く、非線形励起が高次のため、組織への浸透がより深くなります。ただし、3光子励起用の色素の断面積が比較的小さく、約10nmであるため、3光子顕微鏡ではより高出力のレーザーが必要です。これは、一般的な2光子励起の断面積である10nmよりもはるかに小さいです。^[7]超短パルスは通常約100 fsです。 ${\displaystyle 10^{-82}{\text{cm}}^{6}(s/{\text{光子}})^{2}}$${\displaystyle 10^{-49}{\text{cm}}^{4}s/{\text{光子}}}$

3光子蛍光走査顕微鏡の場合、3次元強度点広がり関数（IPSF）は次のように表される。

${\displaystyle h_{i}(\nu ,u)=\left|I_{1}(\nu /3,u/3)\right|^{3}I_{2}(\nu ,u)\otimes _{3}D}$, ^[8]

ここで、は3次元畳み込み演算、は非干渉検出器の強度感度、はそれぞれ単光子蛍光における対物レンズと集光レンズの3次元IPSFを表す。3次元IPSFは次のように表される。 ${\displaystyle \otimes _{3}}$${\displaystyle D}$${\displaystyle I_{1}(\nu ,u)}$${\displaystyle I_{2}(\nu ,u)}$${\displaystyle I_{1}(\nu ,u)}$

${\displaystyle I_{1}(\nu ,u)=\left|\int _{0}^{1}2J_{0}(\nu \rho )\exp(iu/2)\rho d\rho \right|^{2}}$, ^[8]

ここで、はゼロ次の第一種ベッセル関数である。軸座標と半径座標は次のように定義される。 ${\displaystyle J_{0}}$${\displaystyle u}$${\displaystyle \nu}$

${\displaystyle u=(8\pi /\lambda _{f})z\sin ^{2}(\alpha _{0}/2)}$そして

${\displaystyle \nu =(2\pi /\lambda _{f})r\ \sin \ \alpha _{0}}$, ^[8]

ここで、は対物レンズの開口数、は実際の焦点ずれ、は半径座標です。 ${\displaystyle \alpha _{0}}$${\displaystyle z}$${\displaystyle r}$

相関画像は、 2PEF、3PEF、第三高調波発生（THG）などの異なる多光子方式を並行して使用することで取得できます（対応する波長が異なるため、異なる検出器に簡単に分離できます）。その後、マルチチャンネル画像が構築されます。^[9]

3PEFは2PEFとも比較され、放出される信号が2PEFよりも小さい場合でも、深さによる信号対背景比（SBR）の低下は一般的に小さくなります。^[9]

三光子励起蛍光がSinghとBradleyによって観察され、Hellによってさらに検証された後、Chris XuとWatt W. Webbは、いくつかの天然色素と生物学的指標の励起断面積の測定を報告し、生細胞のレーザー走査顕微鏡法に三光子励起蛍光を実装しました。^[10] 1996年11月、David Wokosinは、固定された生体内生物標本のイメージングに三光子励起蛍光を適用しました。

2010年代には、1060 nmを超える励起波長を使用して、三光子顕微鏡が深部組織イメージングに応用されました。2013年1月、Horton、Wang、Kobat、Xuは、1700 nmの長波長ウィンドウで三光子顕微鏡にポイントスキャン法を採用することで、無傷のマウス脳のin vivo深部イメージングを発明しました。 ^[4] 2017年2月、Dimitre Ouzounov、Tainyu Wang、Chris Xuは、1300 nmの波長ウィンドウで三光子顕微鏡を使用し、無傷の成体マウス脳の海馬にあるGCaMP6標識ニューロンの深部活動イメージングを実証しました。^[11] 2017年5月、Rowlandsは、より大きな浸透深度を実現するために、広視野三光子励起を三光子顕微鏡に適用しました。^[12] 2018年10月、T Wang、D Ouzounov、C Xuは、マウスの頭蓋骨を通して三光子顕微鏡を使用して血管とGCaMP6カルシウム活性を画像化することができました。^[13]

3光子顕微鏡法は、神経科学^[14]や腫瘍学^[15]など、2光子励起顕微鏡法と同様の応用分野があります。しかし、標準的な単一光子または2光子励起と比較して、3光子励起には、より長い波長を使用することで光散乱の影響が低減し、照明ビームのサンプルへの浸透深度が増加するなど、いくつかの利点があります。^[16] 3光子顕微鏡法の非線形性により、励起ターゲットがより小さな体積に限定され、焦点外の光が低減し、生物学的サンプルの光退色が最小限に抑えられます。^[16] 3光子顕微鏡法のこれらの利点により、散乱組織の深部にある細胞レベルでの生体内および生体外の組織形態と生理を可視化すること^[4]と、迅速な体積イメージングにおいて優位性があります。^[17]最近の研究では、Xuは、生きた生物系の非侵襲的研究における3光子イメージングの可能性を実証しました。^[13]この論文では、1,320 nmの励起スペクトルウィンドウで3光子蛍光顕微鏡を使用し、高い空間および時間分解能（横方向および軸方向のFWHMはそれぞれ0.96μmと4.6μm）と大きなFOV（数百マイクロメートル）で、かなりの深度（> 500μm）で、マウスの脳の構造と機能を無傷の頭蓋骨を通して画像化しました。この研究は、以前に報告された高密度標識サンプルの深部画像化における3PMの利点に加えて、高散乱層を介した画像化における高次非線形励起の利点を実証しています。1560 nmでの3光子励起を使用した生体内での光スイッチ薬物の局所異性化も報告されており、薬理学的に特異的な方法で神経活動を制御するために使用されています。^[18]

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