異核単量子コヒーレンス分光法

15N HSQC実験は^、タンパク質NMRにおいて最も頻繁に行われる実験の一つです。HSQC実験は^15N同位体の天然存在比を用いて実施できますが、通常、タンパク質NMRでは同位体標識タンパク質が使用されます。このような標識タンパク質は、通常、 ^15N標識培地で培養した細胞内でタンパク質を発現させることによって作製されます。

プロリンを除くタンパク質の各残基には、ペプチド結合の窒素に結合したアミドプロトンがあります。HSQCは窒素とアミドプロトンの相関を提供し、各アミドはHSQCスペクトルにピークを示します。したがって、各残基（プロリンを除く）はスペクトルに観測可能なピークを生成する可能性がありますが、実際には、多くの要因によりすべてのピークが常に観測されるわけではありません。通常、N末端残基（NH ₃ ⁺基が結合している）は、溶媒との交換により容易には観測できません。^{[ 3 ]}主鎖アミド共鳴に加えて、窒素に結合したプロトンを持つ側鎖もピークを生成します。

典型的なHSQCスペクトルでは、アスパラギンとグルタミンの側鎖のNH2ピークは_右上隅に二重線として現れ、 NMRサンプルに通常添加されるD2Oからの重水素交換により、各ピークの上に小さなピークが現れる場合があり、これらの側鎖ピークは特徴的な形状を呈します。_{トリプトファン}の側鎖アミンピークは通常低磁場側にシフトし、左下隅付近に現れます。グリシンの主鎖アミドピークは通常、スペクトルの上部付近に現れます。

15N HSQCは通常、共鳴の帰属のために取得される最初の異核スペクトルであり^、各アミドピークはタンパク質中の特定の残基に割り当てられます。タンパク質が折り畳まれている場合、ピークは通常よく分散しており、個々のピークのほとんどを区別できます。スペクトルの中央付近に大きく重なり合ったピークの大きなクラスターがある場合、それはタンパク質中にかなりの非構造要素が存在することを示しています。共鳴が大きく重なり合っている場合、スペクトル中の共鳴の帰属は困難になることがあります。HSQCスペクトルの帰属には、他の実験、理想的には^15Nおよび^13C標識タンパク質を用いた三重共鳴実験が必要です。これらの実験では、残基間の連続的な連結性が得られ、共鳴を特定の残基にリンクさせて、順次割り当てることができます。スペクトルの帰属は、構造決定や緩和解析などのより高度なNMR実験を意味のある形で解釈するために不可欠です。

¹⁵ N同位体で標識された化学物質は比較的安価であり、¹⁵ N HSQCは比較的短時間でスペクトルを取得できる高感度な実験であるため、^{15 N HSQCは、NMRによる}構造決定の適性やサンプル条件の最適化のために候補をスクリーニングするためによく使用されます。時間のかかる構造決定プロセスは、通常、良好なHSQCスペクトルが得られるまで実行されません。HSQC実験は、タンパク質間相互作用における結合界面や、薬剤などのリガンドとの相互作用を検出するのにも役立ちます。遊離タンパク質のHSQCとリガンドに結合したHSQCを比較すると、いくつかのピークの化学シフトの変化が観察される可能性があり、これらのピークは、結合によって化学シフトが摂動された結合表面上に存在する可能性が高いです。^{[ 4 ]} 15 N HSQC^{は、タンパク質の分子動力学の研究、}イオン化定数の決定、その他の研究における緩和解析にも使用できます。

この実験では、炭素とそれに結合したプロトンとの相関関係が得られます。¹ H— ^{13 C HSQC の定時間 (CT) バージョンは、スペクトル分解能を低下させる同核13} C— ¹³ C Jカップリングによる信号の分裂の問題を回避するため、通常使用されます。^{[ 5 ]} 「定時間」とは、この実験で一定に保たれる 2 つの INEPT ステップ間の進化期間全体を指します。 この進化期間をJ カップリング定数の逆数に設定すると、奇数個の脂肪族炭素が結合している炭素の磁化の符号は、偶数個の脂肪族炭素が結合している炭素の磁化の符号と逆になります。 例えば、ロイシンのC _{β が}正のピーク (脂肪族炭素 2 個が結合) として現れる場合、C _γ (脂肪族炭素 3 個が結合) と C _α (脂肪族炭素 1 個が結合) は負になります。

¹ H- ³¹ P HSQCの使用は脂質オミクスでは比較的まれですが、脂質オミクスにおける³¹ P の使用は 1990 年代に遡ります。^{[ 6 ]}この技術の使用は、より大きなサンプルサイズを必要とするため、質量分析法に比べて制限されていますが、¹ H- ³¹ P HSQC と質量分析法の組み合わせは、脂質オミクスへの徹底的なアプローチと見なされており、「デュアル分光法」の技術が利用可能になりつつあります。^{[ 7 ]}

• タンパク質NMR分光法 ：原理と実践（1995年）ジョン・キャバナ、ウェイン・J・フェアブラザー、アーサー・G・パーマー3世、ニコラス・J・スケルトン、アカデミック・プレス