異核単一量子コヒーレンス分光法

異核単一量子コヒーレンス実験または異核単一量子相関実験は、通常HSQCと略され、有機分子のNMR分光法で頻繁に使用され、タンパク質 NMRの分野で特に重要です。この実験は、1980 年にGeoffrey Bodenhausenと DJ Rubenによって初めて説明されました。 ^[1] 結果として得られるスペクトルは 2 次元 (2D) で、1 つの軸は陽子 ( ¹ H)、もう 1 つの軸は異核 (陽子以外の原子核) (通常は13 ^Cまたは15 ^N )です。スペクトルには、検討対象の異核に結合した各固有の陽子のピークが含まれます。2D HSQC は、NOESY-HSQC や TOCSY-HSQC などの高次元 NMR 実験の他の実験と組み合わせることもできます。

HSQC 実験は、高感度の2D-NMR実験であり、最初は¹ H— ^{15 N システムで説明されましたが、 1} H— ¹³ C や¹ H— ³¹ Pなどの他の核にも適用できます。この実験の基本的なスキームでは、 INEPT (分極移動によって強化された無感度核) ステップを介して、陽子の磁化を 2 番目の核 ( ¹⁵ N、¹³ C、または³¹ P)に移動します。時間遅延 ( t ₁ ) の後、磁化は逆 INEPT ステップを介して陽子に戻され、信号が記録されます。HSQC では、時間遅延t ₁が増加する一連の実験が記録されます。¹ H 信号は各実験で直接測定された次元で検出され、¹⁵ N または¹³ Cの化学シフトは、一連の実験から形成された間接次元で記録されます。

¹⁵ N HSQC実験は、タンパク質 NMR で最も頻繁に記録される実験の 1 つです。HSQC 実験は、 ¹⁵ N同位体の天然存在比を使用して実行できますが、通常、タンパク質 NMR では同位体標識タンパク質が使用されます。このような標識タンパク質は通常、 ¹⁵ N 標識培地で増殖した細胞でタンパク質を発現させることによって生成されます。

プロリンを除くタンパク質の各残基は、ペプチド結合の窒素に結合したアミドプロトンを持っています。HSQCは窒素とアミドプロトンの相関関係を示し、各アミドはHSQCスペクトルでピークを生成します。したがって、各残基（プロリンを除く）はスペクトルで観察可能なピークを生成できますが、実際にはいくつかの要因によりすべてのピークが常に見られるわけではありません。通常、N末端残基（NH ₃ ⁺基が結合している）は、溶媒との交換により容易に観察できません。^[3] バックボーンのアミド共鳴に加えて、窒素に結合したプロトンを持つ側鎖もピークを生成します。

典型的な HSQC スペクトルでは、アスパラギンとグルタミンの側鎖からのNH ₂ピークが右上隅に二重線として現れ、通常 NMR サンプルに添加されるD ₂ Oからの重水素交換により、各ピークの上に小さなピークが現れ、これらの側鎖ピークに独特の外観を与えます。トリプトファンからの側鎖アミン ピークは通常、下方向にシフトし、左下隅近くに現れます。グリシンのバックボーン アミド ピークは通常、スペクトルの上部近くに現れます。

¹⁵ N HSQCは通常、共鳴の割り当てのために取得される最初の異核スペクトルであり、各アミド ピークはタンパク質の特定の残基に割り当てられます。タンパク質が折り畳まれている場合、ピークは通常よく分散しており、個々のピークのほとんどを区別できます。スペクトルの中央付近に、重なり合ったピークの大きなクラスターがある場合は、タンパク質に重要な非構造化要素が存在することを示します。共鳴が重なり合うこのような場合、スペクトルの共鳴の割り当ては困難になる可能性があります。HSQC スペクトルの割り当てには、他の実験が必要です。理想的には、¹⁵ N および¹³ Cでラベル付けされたタンパク質を使用した三重共鳴実験を使用して、残基間の連続的な接続性を提供し、共鳴を特定の残基にリンクして連続的に割り当てることができます。スペクトルの割り当ては、構造決定や緩和分析 などのより高度な NMR 実験を意味のある形で解釈するために不可欠です。

¹⁵ N同位体で標識された化学物質は比較的安価であり、¹⁵ N HSQCは比較的短時間でスペクトルを取得できる感度の高い実験であるため、^{15 N HSQCは、NMRによる}構造決定の適合性やサンプル条件の最適化のための候補のスクリーニングによく使用されます。時間のかかる構造決定プロセスは、通常、良好なHSQCスペクトルが得られるまで実行されません。HSQC実験は、タンパク質間相互作用や薬物などのリガンドとの相互作用における結合界面の検出にも役立ちます。遊離タンパク質のHSQCをリガンドに結合したHSQCと比較すると、いくつかのピークの化学シフトの変化が観察される場合があり、これらのピークは結合によって化学シフトが乱された結合表面にある可能性があります。^{[4] 15} N HSQCは、タンパク質の分子動力学の研究、イオン化定数の決定、およびその他の研究における緩和分析にも使用できます。

この実験は、炭素とそれに結合した陽子との相関関係を示します。1 H— ^{13 C HSQC の一定時間 (CT) バージョンは、スペクトル分解能を低下させる同核13} C— ¹³ C J結合による信号分割の問題を回避するため、通常は使用されます。 ^[5] 「一定時間」とは、この実験で一定に保たれる 2 つの INEPT ステップ間の全進化期間を指します。この進化期間がJ 結合定数の逆数に設定されている場合、奇数の脂肪族炭素が結合した炭素の磁化の符号は、偶数の脂肪族炭素が結合した炭素の磁化の符号と逆になります。たとえば、ロイシンのC _{β が}正のピーク (2 つの脂肪族炭素が結合) として現れる場合、C _γ (3 つの脂肪族炭素が結合) と C _α (1 つの脂肪族炭素が結合) は負のピークとして現れます。

¹ H- ³¹ P HSQCの使用は脂質組成分析では比較的一般的ではありませんが、脂質組成分析における³¹ P の使用は 1990 年代にまで遡ります。^[6] この技術は、より大きなサンプルサイズを必要とするため、質量分析法での使用は制限されていますが、¹ H- ³¹ P HSQC と質量分析法の組み合わせは脂質組成分析に対する徹底したアプローチとみなされており、「デュアル分光法」の技術が利用可能になりつつあります。^[7]

• タンパク質NMR
• 核磁気共鳴
• タンパク質構造
• 構造生物学

• タンパク質NMR分光法：原理と実践（1995）ジョン・キャヴァナ、ウェイン・J・フェアブラザー、アーサー・G・パーマーIII、ニコラス・J・スケルトン、アカデミック・プレス

• タンパク質NMR タンパク質NMRスペクトル