分離（微生物学）

微生物学において、分離という用語は、水や土壌などの環境中に存在する、または皮膚フローラ、口腔フローラ、腸内フローラを持つ生物から、自然の生きた微生物の混合集団から株を分離し、目的の微生物を特定することを指します。 ^[1]歴史的に、分離の実験技術は、20世紀のウイルス学よりも前に、細菌学と寄生虫学の分野で最初に開発されました（19世紀）。

微生物を分離する実験技術は、 19世紀に細菌学と寄生虫学の分野で光学顕微鏡を使用して初めて開発されました。1860年には、ルイ・パスツールが液体培地の導入に成功しました。パスツールが開発した液体培養により、特定の細菌の増殖を促進または阻害する様子を視覚化できるようになりました。この同じ技術は、今日ではマンニトール塩寒天などのさまざまな培地で利用されています。固体培養は、1881年にロバート・コッホが寒天を加えて液体培地を固体化したときに開発されました^[2]

20 世紀以前には、ウイルス学の適切な分離技術は存在しませんでした。微生物の分離方法は、機械化の進展による労働面、関連する技術、それに伴う速度と精度の面で、過去 50 年間で劇的に変化しました。

水中や土壌の細菌叢などの環境中に存在する、あるいは皮膚細菌叢、口腔細菌叢、腸内細菌叢を持つ生物から、微生物を自然の混合集団から分離するには、その混合物から微生物を分離する必要があります。

従来、微生物は、その成長特性に基づいて対象の微生物を識別するために培養されてきました。液体サンプルに存在する微生物の予想される密度と生存率に応じて、連続希釈や遠心分離などの勾配を高める物理的方法を選択できます。下水、土壌、便などの微生物含有量の高い材料内の生物を分離するには、連続希釈によって混合物を分離できる可能性が高くなります。

通常は無菌である領域（脳脊髄液、循環器系内の血液など）から採取した、予想される微生物がほとんどまたは全く存在しない液体培地では、遠心分離を行い、上清をデカントして沈殿物のみを使用すると、細菌または通常は細胞に関連するウイルスを増殖させて分離する可能性が高まります。

特に扱いが難しい微生物を予想または探す場合、微生物培養および分離技術はその微生物に合わせて調整する必要があります。たとえば、空気にさらされると死んでしまう細菌は、サンプルを無気または嫌気条件下で運搬および処理した場合にのみ分離できます。室温にさらされると死んでしまう細菌 (好熱性) には、事前に温めた運搬容器が必要です。また、綿棒で運搬すると乾燥して死んでしまう微生物は、培養を成功させる前にウイルス運搬媒体が必要になります。

実験室技術者は、分離の目的に応じて、 画線法で特定の固体寒天プレートにサンプルを接種するか、液体培養培地にサンプルを接種します。

• 咽頭スワブからA群連鎖球菌などの特定の細菌群のみを分離したい場合は、混合物中に予想される同時細菌の増殖を抑制する選択培地（寒天培地中に存在する抗生物質による）を使用して、連鎖球菌のみが「選択」され、つまり目に見えるようにすることができます。 ^[3]真菌を分離するには、サブロー寒天培地を使用することができます。あるいは、マンニトール塩寒天培地中の高塩濃度のような連鎖球菌およびグラム陰性細菌にとって致死的な条件は、腸内細菌サンプル中に存在するブドウ球菌の生存に有利であり、寒天培地中のフェノールレッドは、細菌が培地に酸を排出してマンニトールを発酵できるかどうかを示すpH指示薬として機能します。他の寒天培地では、細菌のコロニーの色を変える目に見える色素を生成する生物の能力を利用する物質（例：B群連鎖球菌用のグラナダ培地）が添加されたり、血液寒天培地を溶血によって溶解してより簡単に見つけられるようにしたりします。レジオネラ属菌のような一部の細菌は、成長するために木炭のような特定の栄養素や毒素結合を必要とするため、緩衝木炭酵母エキス寒天培地などの培地を使用する必要があります。
• できるだけ多くの、またはすべての菌株を分離したい場合は、血液寒天やチョコレート寒天などの栄養培地や、チオグリコール酸ブロスなどの嫌気性培地など、さまざまな栄養培地に接種する必要があります。増殖を数えるには、細菌を凝固する前に融解した寒天に懸濁し、ペトリ皿に注ぎます。これは、いわゆる「混釈平板法」で、環境微生物学や食品微生物学（乳製品検査など）で、いわゆる「好気性平板菌数」を確定するために使用されます。

サンプルを選択培地に接種した後、好気性、嫌気性、微好気性条件などの適切な大気設定、または二酸化炭素（5%）を添加した状態で、さまざまな温度設定（たとえば、低温増菌の場合はインキュベーター内の37℃または冷蔵庫内）、適切な光（たとえば、スコトクロモゲンマイコバクテリアの場合は紙で包んで完全に光を遮断するか暗瓶に入れる）で、さまざまな時間（細菌によって成長速度が異なり、数時間（大腸菌）から数週間（マイコバクテリアなど））で培養します。

定期的に、実験室の技術者と微生物学者が培地を検査し、目に見える成長の兆候がないか確認し、記録します。検査は、分離株の生存に有利な条件、つまり嫌気性細菌の場合は「嫌気性チャンバー」で、また、プレートを観察する人が特に感染性の高い微生物に感染する恐れのない条件、つまりペスト菌（ペスト）や炭疽菌（炭疽菌）の場合は生物学的安全キャビネットで実施する必要があります。

細菌が目に見えて増殖しているときでも、それらはまだ混ざっていることが多い。微生物の同定は個々のコロニーの分離に依存し、微生物のさまざまな生理学的特徴を判断するための生化学検査は純粋培養に依存する。継代培養を行うには、再び微生物学の無菌技術で作業し、ループを使用して寒天表面から単一のコロニーを持ち上げ、寒天プレートの4つの象限に材料を塗るか、コロニーが単一で混ざっていないように見える場合は全体に塗る。

グラム染色は、一連の染色と脱色工程を経て細菌が染色した色に基づいて細菌の細胞壁構成を視覚化することを可能にする。^{[4]この染色プロセスにより、}グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の識別が可能になる。グラム陰性細菌はペプチドグリカンの薄い層のためピンク色に染色される。細菌がペプチドグリカンの厚い層のため紫色に染色される場合、その細菌はグラム陽性細菌である。^[4]

臨床微生物学では、特定の微生物に対する他の多数の染色技術が使用されています (抗酸菌に対する抗酸菌染色)。直接免疫蛍光法などの免疫染色技術は、成長が遅い (抗酸菌に対するオーラミン-ローダミン染色) か、成長が困難な (レジオネラ・ニューモフィラ属など)医学的に重要な病原体や、検査結果によって標準的な管理や経験的治療が変わるような病原体に対して開発されました。

細菌の生化学検査では、運動性細菌と非運動性細菌を分離するために、バイアルに寒天培地をセットします。1970 年には、分析プロファイル インデックスと呼ばれる小型版が開発されました。

ゲノム配列解析やゲノミクスなどによる同定が成功するかどうかは、純粋培養に依存します。

細菌を同定する最も迅速な方法は、事前にPCR増幅された16S rRNA遺伝子の配列を決定することですが、この方法では分離は必要ありません。ほとんどの細菌は従来の方法では増殖できないため（特に環境細菌や土壌細菌）、メタゲノミクスまたはメタトランスクリプトミクス、つまりゲノムのショットガン配列決定またはPCR誘導配列決定が使用されます。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI-TOF MS）などの質量分析による配列決定は、病原体を探すための臨床検体の分析に使用されます。全ゲノム配列決定は、同定のために十分に特徴付けできない単一の生物に対するオプションです。小型DNAマイクロアレイも同定に使用できます。