メタトランスクリプトミクス

メタトランスクリプトミクスは、自然環境における微生物の遺伝子発現、すなわちメタトランスクリプトームを研究するために使用される一連の技術です。 ^[1]

メタゲノミクスはゲノム内容の研究とコミュニティ内に存在する微生物の特定に重点を置いていますが、メタトランスクリプトミクスは、そのようなコミュニティ内の活性遺伝子の多様性の研究、それらの発現レベルの定量化、およびこれらのレベルがさまざまな条件（生物の生理的条件と病理的条件など）でどのように変化するかの監視に使用できます。メタトランスクリプトミクスの利点は、同様の構成を持つように見える微生物コミュニティの活性機能の違いに関する情報を提供できることです。 ^[2]

マイクロバイオームは、明確に定義された生息地を占める微生物群集として定義されています。^[3]これらの群集は遍在しており、環境の特性維持に重要な役割を果たします。また、これらの群集の不均衡は、それらが存在する環境の活動に悪影響を及ぼす可能性があります。これらの群集を研究し、その影響とニッチとの相関関係を判断するために、さまざまなオミクス手法が使用されてきました。メタゲノミクスは、研究者がサンプルの分類プロファイルを作成するのに役立ちますが、メタトランスクリプトミクスは、群集によってどの遺伝子が発現されているかを分析することで機能プロファイルを提供します。特定の条件下でどの遺伝子が発現されているかを推測することができ、これは発現された遺伝子の機能的注釈を使用して行うことができます。

メタトランスクリプトミクスはどの遺伝子が発現しているかに焦点を当てているため、微生物群集全体の活性機能プロファイルを特徴付けることができます。^[4]特定のサンプルにおける遺伝子発現の概要は、マイクロバイオームの全mRNAをキャプチャし、全メタトランスクリプトミクスショットガンシーケンスを実行することによって得られます。

マイクロアレイは一部のモデル生物の遺伝子発現プロファイルを決定するために利用できますが、メタトランスクリプトミクスでは次世代シーケンシングと第三世代シーケンシングが好まれる手法です。メタトランスクリプトーム解析を実行するために使用されるプロトコルは、解析が必要なサンプルの種類によって異なる場合があります。実際、微生物サンプルのメタトランスクリプトームを研究するために、さまざまなプロトコルが開発されています。一般的に、サンプルの収集、RNA 抽出(文献ではサンプルの種類ごとに異なる抽出方法が報告されています)、mRNA エンリッチメント、cDNA 合成、メタトランスクリプトーム ライブラリの準備、シーケンシング、データ処理と解析の手順が含まれます。mRNA エンリッチメントは、技術的に最も難しい手順の 1 つであり、さまざまな戦略が提案されています。

• リボソームRNA捕捉によるrRNAの除去
• 5-3エキソヌクレアーゼを使用して処理されたRNA（主にrRNAとtRNA）を分解する^[5]
• ポリAポリメラーゼ（大腸菌）を用いてmRNAにポリ(A)を付加する
• 抗体を使用して特定のタンパク質に結合するmRNAを捕捉する

最後の2つの戦略は、非常に偏りがあると報告されているため、推奨されません。^[6]

典型的なメタトランスクリプトーム解析パイプライン:

• 読み取りを参照ゲノムにマッピングする、または
• 読み取り結果を転写コンティグとスーパーコンティグにデノボアセンブリする

最初の戦略は、データベース内の参照ゲノムにリードをマッピングし、単一遺伝子の相対的発現を推測するのに役立つ情報を収集します。メタトランスクリプトミクスのリードは、Bowtie2、BWA、BLASTなどのアライメントツールを使用してデータベースに対してマッピングされます。次に、 GO、KEGG、COG、Swiss-Protなどのリソースを使用して結果に注釈が付けられます。結果の最終分析は、研究の目的に応じて実行されます。最新のメタトランスクリプトミクス技術の1つは安定同位体プローブ（SIP）であり、湖沼堆積物中の好気性微生物の特定の標的トランスクリプトームを取得するために使用されています。 ^[7]この戦略の制限は、データベース内の参照ゲノムの情報に依存していることです。

2番目の戦略は、異なるソフトウェアを使用してメタトランスクリプトームの読み取りをコンティグと呼ばれるより長い断片に組み立てることで、さまざまな遺伝子の発現の豊富さを取得します。RNA -seq用のTrinityソフトウェアは、他のde novoトランスクリプトームアセンブラーと比較して、ゲノムアラインメントに依存する方法と同様の感度で、幅広い発現レベルにわたってより多くの完全長トランスクリプトを回復すると報告されています。これは、参照ゲノムがない場合に特に重要です。^[8]

トランスクリプトーム解析のための定量的パイプラインはLiとDeweyによって開発され^[9]、RSEM（RNA-Seq by Expectation Maximization）と呼ばれています。これはスタンドアロンソフトウェアとしても、Trinityのプラグインとしても機能します。RSEMは、サンプルから生成されたRNA-Seqリードとともに参照トランスクリプトームまたはアセンブリから開始し、正規化されたトランスクリプトの存在量（各参照トランスクリプトームまたはアセンブリに対応するRNA-Seqリードの数を意味します）を計算します。^{[10] [11]}

TrinityとRSEMはどちらもトランスクリプトミクスデータセット（つまり、単一の生物から得られたデータセット）用に設計されていますが、メタトランスクリプトミクスデータ（つまり、微生物群集全体から得られたデータ）に適用できる可能性があります。^{[12] [13] [14] [15] [16] [17]}

DNAシーケンシング能力の向上に伴い、特に膨大な量のデータを生成するメタゲノム解析やメタトランスクリプトミクス解析において、計算解析ツールの使用がますます重要になってきています。これらの目的のために、HUMAnNや、最近ではHUMAnN2、MetaTrans、SAMSA、Leimena-2013、mOTUs2などのオープンソースプラットフォームとして、さまざまなバイオインフォマティクスパイプラインが開発されてきました。^[18]

HUMAnN2は、ヒトマイクロバイオームプロジェクト（HMP）中に開発された以前のHUMAnNソフトウェアから設計されたバイオインフォマティクスパイプラインであり、「階層型検索」アプローチを実装しています。第1層では、HUMAnN2はMetaPhlAn2を使用してDNAまたはRNAリードをスクリーニングし、既知の微生物を特定し、注釈付き種のパンゲノムをマージしてサンプル固有のデータベースを構築します。第2層では、アルゴリズムは組み立てられたパンゲノムデータベースに対してリードのマッピングを実行します。第3層では、非アラインメントリードを使用してタンパク質データベースに対して翻訳検索を行います。^[19]

MetaTrans は、マルチスレッドを活用して効率を向上させるパイプラインです。データはペアエンド RNA-Seq から取得され、主に分類用の16S RNAと遺伝子発現レベル用の mRNA から取得されます。パイプラインは 4 つの主要なステップに分かれています。まず、ペアエンド リードは品質管理の目的でフィルタリングされ、次に分類分析 (tRNA シーケンスの削除による) または機能分析 (tRNA と rRNA の両方のリードの削除による) のために並べ替えとフィルタリングが行われます。分類分析の場合、シーケンスは SOAP2 を使用して 16S rRNA Greengenes v13.5 データベースに対してマッピングされ、機能分析の場合、シーケンスは常に SOAP2 ツールを使用して MetaHIT-2014 などの機能データベースに対してマッピングされます。このパイプラインは、一般的な構造が保持されている限り、サードパーティのツールを使用して単一のモジュールを改善できるため、非常に柔軟です。^[20]

このパイプラインは、メタゲノミクス用のMG-RASTサーバーと連携して、メタトランスクリプトミクスデータ分析用に特別に設計されています。このパイプラインは使い方が簡単で、技術的な準備や計算能力をほとんど必要とせず、幅広い微生物に適用できます。まず、生のシーケンスデータからのシーケンスが品質に基づいてフィルタリングされ、次にMG-RASTに送信されます（MG-RASTは、品質管理、遺伝子呼び出し、アミノ酸シーケンスのクラスタリング、各クラスターでのsBLATの使用など、さらにステップを実行して最適な一致を検出します）。次に、一致は分類および機能分析の目的で集約されます。^[21]

このパイプラインには正式な名前はなく、通常はそれが説明されている論文の第一著者名で呼ばれる。このアルゴリズムは、BLASTやMegaBLASTなどのアライメントツールの実装を予見している。リードは同一配列のグループにまとめられ、その後、tRNAおよびrRNA配列のin-silico除去処理が行われる。残りのリードは、BLASTおよびMegaBLASTを使用してNCBIデータベースにマッピングされ、ビットスコアによって分類される。ビットスコアの高い配列は、系統発生の起源と機能を予測するために使用され、スコアの低いリードは、より感度の高いBLASTXでアライメントされ、最終的にはタンパク質データベースでアライメントされて、その機能を特徴付けることができる。^[12]

必須のハウスキーピング遺伝子に基づくmOTUs2プロファイラー^[22]は、微生物群集メンバーの基礎転写活性の定量化に適していることが実証されています。^[要出典]環境条件に応じて、ほとんどの遺伝子の細胞あたりの転写産物の数は異なります。例外は、さまざまな条件下で構成的に発現し、変動が少ないハウスキーピング遺伝子です。^[要出典]したがって、このような遺伝子からの転写産物の豊富さは、群集内の活性細胞が豊富であることに強く相関しています。

メタトランスクリプトミクスの目的に利用できるもう 1 つの方法は、タイリング マイクロアレイです。特に、マイクロアレイは微生物の転写レベルの測定、新しい転写の検出、mRNA の構造に関する情報の取得 (UTR 境界など) に使用されています。最近では、新しい制御 ncRNA の発見にも使用されています。ただし、マイクロアレイにはいくつかの落とし穴があります。

• プローブ設計の要件
• 低感度
• 遺伝子ターゲットに関する事前の知識。

RNA-Seqはこれらの制限を克服することができます。分析対象となるゲノムに関する事前の知識を必要とせず、遺伝子の予測、構造、発現のハイスループット検証を提供します。したがって、2つのアプローチを組み合わせることで、細菌のトランスクリプトームをより完全に表現することが可能になります。^[1]

• リボソーム RNA は圧倒的に多いため、収集された総 RNA における mRNA (通常はトランスクリプトーム研究の主な焦点) の範囲を大幅に減少させます。
• 一部の生物学的サンプルまたは環境サンプル（糞便など）から高品質の RNA を抽出することは困難な場合があります。
• シーケンス前であってもサンプルの完全性を損なう mRNA の不安定性。
• 実験上の問題は、複数のサンプル間の発現の違いの定量化に影響を及ぼす可能性があります。つまり、完全性と入力 RNA だけでなく、サンプルに残っている rRNA の量、サイズ セクション、遺伝子モデルにも影響を及ぼす可能性があります。さらに、分子ベースの技術は、アーティファクトが発生しやすい傾向があります。
• 微生物濃縮用の市販キットは入手可能ですが、宿主と微生物の RNA を区別するのは困難です。宿主の参照ゲノムが利用できる場合は、これをコンピューター内で行うこともできます。
• トランスクリプトーム参照データベースは、その範囲が限られています。
• 一般的に、メタトランスクリプトーム解析では大規模な細胞集団が利用されるため、サブ集団間に存在する可能性のある重要な差異を解決することは困難です。病原体集団の大きな変動は、病気の進行と毒性に影響を及ぼすことが実証されています。^{[引用が必要]}
• マイクロアレイと RNA-Seq の両方において、遺伝子発現のダイナミック レンジが広いため、遺伝子を「発現」として分類するための実際のしきい値を設定することは困難です。
• mRNAの存在は必ずしもそれぞれのタンパク質の実際の存在と関連しているわけではない。^[1]

腸内微生物叢は近年、人間の健康において重要な役割を果たしていることが明らかになっています。その主な機能は、消化できない食品成分の発酵、病原体との競合、腸管バリアの強化、免疫系の刺激と調節に関連しています。^{[23] [24] [25] [26] [27] [28] [29]} 過去数年間で微生物叢コミュニティについて多くのことがわかってきましたが、腸内の微生物と分子の多様性には、新しい発見を可能にする新しいツールが必要です。遺伝子の発現の変化に焦点を当てることにより、メタトランスクリプトミクスは、メタゲノミクスよりも微生物叢の状態と活動のより動的な画像を生成することができます。メタトランスクリプトミクスの機能プロファイルは、メタゲノム情報のみで推定されるものよりも変動が大きいことが観察されています。これは、非ハウスキーピング遺伝子がin situで安定して発現していないことを示唆しています^{[30] [31]}

メタトランスクリプトミクスの応用の一例は、炎症性腸疾患における腸内微生物叢の研究です。炎症性腸疾患（IBD）は、世界中で何百万人もの人々を悩ませている消化管の慢性疾患群です。^[32] ヒトの遺伝子変異のいくつかはIBDに対する感受性の増加と関連していますが、この疾患が完全に発症するには追加の要因が必要です。

IBDと腸内細菌叢の関係については、IBD患者には腸内細菌叢の不均衡があることが知られていますが、微生物の分類プロファイルは患者間で大きく異なる可能性があるため、特定の微生物種または株が病気の発症や進行に関連していることを示唆することは困難です。さらに、腸内細菌叢の構成は人によって経時的に大きく変動し、IBD患者ではその変動がより顕著です。^{[33] [34]} 生物の機能的潜在能力、つまりそのゲノムにコード化された遺伝子と経路は、そのような機能の活性化のレベルまたは範囲に関する間接的な情報しか提供しません。そのため、機能的活動（遺伝子発現）の測定は、腸内細菌叢の不均衡のメカニズムを理解するために重要です。

rRNA発現に基づいて確立されたIBDにおける転写活性の変化は、一部の細菌集団がIBD患者で活性である一方、他のグループは不活性または潜伏性であることを示している。^[35]

腸内微生物叢の機能活性を測定するメタトランスクリプトミクス解析により、IBD の疾患関連観察を含む、メタゲノム機能ポテンシャルで部分的にしか観察できない知見が明らかになる。多くの IBD 特有のシグナルは、RNA レベルでより顕著であるか、または RNA レベルでのみ検出可能であることが報告されている。^[33] これらの変化した発現プロファイルは、炎症レベルの上昇、酸素濃度の上昇、粘液層の減少など、IBD 患者の腸内環境の変化の結果である可能性がある。^[36] メタトランスクリプトミクスの利点は、研究者が生化学生成物 (粘液や酸素など) をその場で分析する手間を省き、大規模なヒト集団における環境変化が生体内での微生物発現パターンに与える影響を評価できることである。さらに、縦断的サンプリングと組み合わせて、活動の変調と疾患の進行を関連付けることもできる。実際、特定のパスはゲノムレベルでは時間の経過とともに安定している可能性があるが、対応する発現は疾患の重症度によって変化することがわかっている。^[33]これは、微生物の不均衡が安定したコミュニティ内の転写プログラムの変化を通じて腸の健康に影響を与えることを示唆しています。このように、メタトランスクリプトームプロファイリングは、その関係のメカニズムを理解するための重要なツールとして浮上しています。

便中の RNA 測定の技術的な制限の一部は、抽出された RNA が分解される可能性があり、分解されない場合でも、便サンプル中に存在する微生物のみを表すという事実に関連しています。

• 指向培養：生物の栄養嗜好を理解することで適切な培養培地を調製し、体外で微生物を分離することに成功しました。^[1]
• 潜在的な毒性因子を特定します。比較トランスクリプトミクスを通じて、特定の刺激後の関連株または種の異なる転写応答を比較します。
• 宿主固有の生物学的プロセスと相互作用を特定する この目的のためには、いくつかの遺伝子の発現レベルの変化を同時に検出できる新しい技術を開発することが重要です。

適用された技術の例: マイクロアレイ: 宿主と病原体の両方で、多数の遺伝子の発現レベルの変化を並行して監視できます。最初のマイクロアレイ手法は、コレラ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、クラミジア・トラコマティス、クラミジア・ニューモニエ、サルモネラ・エンテリカなどの病原体における遺伝子発現の変化の初めての包括的な分析を示し、これらの微生物が宿主に適応するために使用する戦略を明らかにしました。さらに、マイクロアレイは、細菌感染がさまざまな宿主因子の発現に及ぼす影響として、 PAMPに対する宿主の自然免疫応答に関する初めての包括的な洞察を提供します。いずれにしても、マイクロアレイによる両方の生物の同時検出は問題になる可能性があります。問題:

• プローブの選択（数億種類の異なるプローブ）
• クロスハイブリダイゼーション
• 高価なチップ（適切な設計、高密度アレイ）の必要性
• 遺伝子発現解析の前に、病原体と宿主細胞を物理的に分離する必要があります (真核細胞のトランスクリプトームは病原体のトランスクリプトームに比べて大きいため、病原体の RNA からの信号が隠れてしまう可能性があります)。
• 真核細胞の溶解中にRNA分子が失われます。

デュアル RNA-Seq: この技術により、宿主と病原体の両方のトランスクリプトームを同時に研究することもできます。感染プロセスのさまざまな時点で遺伝子の発現を監視できます。この方法では、最初の接触から宿主の操作まで (宿主と病原体の相互作用)、両方の生物の細胞ネットワークの変化を研究できます。

• 潜在性: 高価なチップは不要
• プローブに依存しないアプローチ（RNA-seq は mRNA 配列に関する事前知識なしで転写情報を提供します）
• 高感度。
• 異なる条件下での未知の遺伝子の発現レベルを研究する可能性

さらに、RNA-Seq は共制御遺伝子を特定するための重要なアプローチであり、病原体ゲノムをオペロンに編成することを可能にします。実際、カンジダ・アルビカンス、トリパノソーマ・ブルーセイ、熱帯熱マラリア原虫などの一部の真核病原体ではゲノム注釈が行われています。

現在利用可能なシーケンシングの感度と深度は向上しているにもかかわらず、哺乳類宿主細胞の感染に対する反応に関するRNA-Seq研究はまだほとんど発表されていない。^{[37] [38]}