リコンビナーゼを介したカセット交換

RMCE (リコンビナーゼ媒介カセット交換) は、部位特異的組換えプロセス (SSR)の特徴に基づいて、標的統合によって高等真核生物ゲノムを体系的に繰り返し変更できる逆遺伝学の手順です。RMCE の場合、これは既存の遺伝子カセットを「目的遺伝子」(GOI) を含む類似のカセットとクリーンに交換することで実現されます。

哺乳類細胞の遺伝子改変は、医薬品として適切な改変タンパク質を生成するための標準的な手順です。成功するには、トランスジーンの移入と発現が極めて効率的で、結果がほぼ予測可能である必要があります。遺伝子治療の分野における現在の開発は、同じ原則に基づいています。GOI の移入に使用される従来の手順は、主に、関連するエピジェネティックな影響が十分に調査されていないため、十分に信頼性が高くありません。トランスジーンは、効率が低く、発現に最適な条件を提供しない遺伝子座で染色体に組み込まれます。その結果、新しく導入された情報が実現 (発現) されない可能性があり、遺伝子が失われたり、再挿入されたりして、ターゲット細胞が不安定な状態になる可能性があります。まさにこの点で、RMCE が分野に登場します。この手順は 1994 年に導入され^{[1] 、酵母と}バクテリオファージ^[2]が重要な遺伝情報を効率的に複製するために進化したツールを使用します。

ほとんどの酵母菌株には、「2ミクロンサークル」と呼ばれる環状のプラスミドのようなDNAが含まれています。これらの実体の持続性は、「フリッパーゼ」または「Flp」と呼ばれるリコンビナーゼによって保証されます。この酵素の4つのモノマーは、 FRT（「フリップリコンビナーゼターゲット」）と呼ばれる2つの同一の短い（48bp）ターゲットサイトと結合し、クロスオーバーを引き起こします。このようなプロセスの結果は、関与するFRTの 相対的な方向に依存し、

• 2つの同一だが逆向きのFRT部位に挟まれた配列の反転
• 2つの同じ方向を向いた同一のFRTに挟まれた配列の削除/解決
• 文字プロセスの非効率的な逆戻り。一般的には、ターゲット サイトと同一の単一のFRTサイトを持つ DNA の追加部分の統合または「追加」と呼ばれます。

このオプションの範囲は、拡張された 48 bp FRT部位のスペーサー変異体の生成によって大幅に拡張できます(図 1 の斜線半矢印)。各変異体 Fn は、野生型部位 (F x F) と同等の効率で、同一の変異体 Fn と再結合します。これらのコンポーネントの特定の設計により、相互相互作用 (F x Fn) は厳密に防止されます。これにより、図 1A に示す状況が実現します。

• ターゲットカセット（ここでは複合+/-選択マーカー）は、F-およびFn部位に挟まれている。宿主細胞のゲノムに導入された後、多くの統合部位（ゲノム「アドレス」）の特性が特徴付けられ、適切なクローンが分離される。
• GOI (目的遺伝子) は、環状の「交換プラスミド」の一部であり、一連のマッチング部位に挟まれています。この交換プラスミドは、分子過剰で細胞に導入することができ、それによって、事前に選択されたゲノムアドレス (つまり、F <+/-> Fn ターゲット) との図示された交換 (RMCE-) 反応が行われます。
• このRMCE 原理は、同じまたは異なる交換プラスミド (「シリアル RMCE」) で繰り返すことができるプロセスです。RMCE は、事前に決定された遺伝子座に GOI のコピーを 1 つだけ導入し、免疫学的またはエピジェネティックな防御機構をトリガーする原核生物ベクター シーケンス(点線) を共導入しないことに注意してください。

この新しい手順は、最初にTyr リコンビナーゼFlpに適用されましたが、バイオテクノロジー的に重要な細胞株の合理的な構築に関連しているだけでなく、幹細胞の体系的な生成にもますます使用されています。幹細胞は、損傷した組織を置き換えたり、ほぼ事前に決定された特性を持つトランスジェニック動物を生成したりするために使用できます。

Cre および Flp リコンビナーゼの両方の共発現が、ランダムな位置でゲノムに組み込まれた単一の loxP および FRT サイトによって挟まれた配列の交換を触媒することが、これまでに確立されています。しかし、これらの研究では、そのようなアプローチが、単一または複数の loxP および FRT サイトを持つ条件付きマウス対立遺伝子を変更するために使用できるかどうかは調査されていませんでした。デュアル RMCE (dRMCE、Osterwalder ら、2010) は、野生型 loxP および FRT サイトを持ち、したがって従来の RMCE と互換性がない膨大な数のマウス条件付き対立遺伝子に適用可能なリエンジニアリング ツールとして最近開発されました。一般的な dRMCE 戦略は、ほとんどの条件付き対立遺伝子が、機能的に関連するエクソン (「floxed」エクソン) を挟む loxP サイトに加えて、FRT サイトによって挟まれた選択カセットをコードしているという事実を利用しています。 FRT に挟まれた選択カセットは、一般的に loxP に挟まれた領域の外側に配置され、これらの対立遺伝子は dRMCE と直接互換性があります。Cre および Flp リコンビナーゼの同時発現により、シス組換えと削除された対立遺伝子の形成が誘導され、その後、トランス組換えによって置換ベクターを挿入する「ドッキング サイト」として機能します。正しく置換された遺伝子座は、カスタム変更と、単一の loxP および FRT サイトに挟まれた異なる薬物選択カセットをエンコードします。したがって、dRMCE は、IKMC コンソーシアムによって生成された何千ものマウス対立遺伝子のターゲット再エンジニアリングに非常に効率的なツールであると考えられます。

マルチプレックス化の設定は、各 F-Fn ペア (野生型FRTサイトと「n」と呼ばれる変異体で構成) または各 Fn-Fm ペア (「m」と「n」の 2 つの変異体で構成) がゲノム内の固有の「アドレス」を構成するという事実に依存しています。前提条件は、8 つのスペーサー位置のうち 4 つに違いがあることです (図 1B を参照)。違いがこのしきい値を下回る場合、変異体間の相互相互作用が発生し、異種特異的 (Fm/Fn または F/Fn) サイト間のシーケンスの誤った削除につながる可能性があります。

その間に、 13 種類の FRT 変異体^{[3] [4]}が利用可能になり、これにより、複数の固有のゲノム アドレスを並べて確立できるようになりました (たとえば、F-Fn と Fm-Fo)。これらのアドレスは、同じ原理に従って設計されたドナー プラスミドによって認識され、所定の遺伝子座で連続的な (ただし同期した) 変更が可能になります。これらの変更は、適合するドナー プラスミドが過剰に提供されると (マス アクション原理)、完了まで駆動できます。図 2 は、多重化原理の 1 つの使用例を示しています。これは、基本的な発現ユニットにゲノム インシュレーター、エンハンサー、またはその他のシス作用要素が提供されるコード領域の段階的な拡張です。

一般的な概念の最近のバリエーションは、PhiC31 （Serクラスのインテグラーゼ）に基づいており、これは最初のRMCEベースの変更が発生した後に、二次サイトに別のRMCEターゲットを導入することを可能にします。これは、phiC31が触媒する各交換が、それが対処したattPおよびattBサイトを破壊し、それぞれatt Rおよびatt L製品サイトに変換するという事実によるものです^{[2] 。これらの変更により、その後の新しい（そしておそらくリモートの）ターゲットのマウントが可能になりますが、複数のRMCEターゲットを}並行して対処することはできず、また「シリアルRMCE」、つまり特定のゲノム遺伝子座での連続した段階的な変更も許可されません。

これはFlp-RMCEの場合とは異なり、 FRTのRMCE後の状態は初期状態に対応します。この特性により、互換性のある構造を持つ新しいドナープラスミドを追加することで、ターゲットカセットを意図的に繰り返し移動させることができます。これらの「マルチプレックスRMCE」オプションは、事前に決定されたRMCEターゲットのシリアルおよびパラレルの特定の変更に無限の可能性を開きます^[5]

RMCEによる遺伝子改変とノックアウト/ノックインマウスの作製。^{[6] [7]}

哺乳類宿主細胞株（懸濁培養中のCHO DG44）への標的カセットの挿入と、標的統合（RMCE）によるERストレスレポーター構築物との交換。^[8]

• 部位特異的リコンビナーゼ技術
• 部位特異的組換え
• FLP-FRT組み換え
• Creリコンビナーゼ
• Cre-Lox組み換え
• 遺伝子組み換え
• 相同組換え

• J. Bode、S. Götze、M. Klar、K. Maaß、K. Nehlsen、A. Oumard & S. Winkelmann (2004) BIOForum 34-36 Den Viren nachempfunden: Effiziente Modifikation von Säugerzellen。
• チェーザリ F、レンネカンプ V、ヴィンターステン K、ヴオン LG、ザイブラー J、ボーデ J、ヴィーベル FF、ノルドハイム A (2004)。 「Flpリコンビナーゼ媒介カセット交換によって操作されたElk-1ノックアウトマウス」。ジェネシス。38 (2): 87–92。土井：10.1002/gene.20003。PMID  14994271。
• Roebroek, AJM; Reekmans, S.; Lauwers, A.; Feyaerts, N.; Smeijers, L.; Hartmann, D. (2006). 「RMCE によって生成された変異 Lrp1 ノックイン マウスは、正常な胎児発育における LRP1 の細胞内ドメインの NPXY モチーフの重要性の違いを明らかにしました」。Mol . Cell. Biol . 26 (2): 605–616. doi : 10.1128/MCB.26.2.605-616.2006. PMC  1346909. PMID  16382151.
• Branda, CS; Dymecki, SM (2004). 「革命について語る: マウスの遺伝子解析における部位特異的リコンビナーゼの影響」Develop. Developmental Cell . 6 (1): 7–28. doi : 10.1016/S1534-5807(03)00399-X . PMID  14723844.
• Oumard, A.; Qiao, J.; Jostock, T.; Li, J.; Bode, J. (2006). 「染色体利用の推奨方法: 動物細胞バイオテクノロジーにおける RMCE ベースのカセット交換システム」Cytotechnology . 50 (1–3): 93–108. doi :10.1007/s10616-006-6550-0. PMC  3476001 . PMID  19003073.
• Qiao, J.; Oumard, A.; Wegloehner, W.; Bode, J. (2009). 「新しいタグアンド交換 (RMCE) 戦略により、予測可能で安定したトランスジーン発現特性を持つマスター細胞クローンが生成」J. Mol. Biol . 390 (4): 579–594. doi :10.1016/j.jmb.2009.05.012. hdl : 10033/76653 . PMID  19447116.
• トゥラン、ソーレン。ガラ、メラニー。エルンスト、エレン。喬、潤華。フェルケル、クリスティーン。シールマイヤー、ベルンハルト。ゼヘ、クリストフ。ボーデ、ユルゲン (2011)。 「リコンビナーゼ媒介カセット交換 (RMCE): 従来の概念と現在の課題」。分子生物学ジャーナル。407 (2): 193–221。土井：10.1016/j.jmb.2011.01.004。PMID  21241707。
• Turan, S; Zehe, C; Kuehle, J; Qiao, J; Bode, J (2013). 「リコンビナーゼ媒介カセット交換 (RMCE) – 標的ゲノム改変のための急速に拡大するツールボックス」. Gene . 515 (1): 1–27. doi :10.1016/j.gene.2012.11.016. PMID  23201421.
• Lauth, M.; Spreafico, F.; Dethleffsen, K.; Meyer, M (2002). 「2 つの部位特異的リコンビナーゼの併用による非選択条件下での安定かつ効率的なカセット交換」Nucleic Acids Res . 30 (21): e115. doi :10.1093/nar/gnf114. PMC  135837 . PMID  12409474.
• Osterwalder, Marco; Galli, Antonella; Rosen, Barry; Skarnes, William C; Zeller, Rolf; Lopez-Rios, Javier (2010). 「マウス変異アレルの効率的な再エンジニアリングのためのデュアル RMCE」. Nature Methods . 7 (11): 893–895. doi :10.1038/nmeth.1521. PMC  3576631. PMID  20953177.

• https://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111130115822.htm