大腸菌の長期進化実験

大腸菌は通常、酸素が存在するとクエン酸トランスポーターを発現できないため、クエン酸上で好気的に増殖することができません。 ^{[ 11 ]}しかし、大腸菌は完全なクエン酸回路を持っているため、グルコースなどの他の物質上で好気的に増殖する際に、クエン酸を中間体として代謝します。ほとんどの大腸菌は、グルコースなどの共基質が還元力を提供する場合、発酵によってクエン酸上で嫌気的に増殖することができます。 ^{[ 9 ] [ 11 ] [ 41 ] [ 42 ]}嫌気的増殖は、1998年に初めて同定された膜貫通型クエン酸-コハク酸アンチポーター遺伝子citTの発現によって可能になります。この遺伝子は、酸素が存在しない場合にのみオンになるcitオペロン上に存在するクエン酸発酵に関与する他の遺伝子と共調節されています。^{[ 11 ] [ 43 ]}

^{クエン酸上で好気的に増殖できないこと（Cit −}表現型と呼ばれる）は、大腸菌という種の特徴であり、大腸菌を病原性サルモネラ菌から区別する貴重な手段となっている。環境や農業サンプルから大腸菌のCit ⁺株が分離されているが、そのような場合、その形質は外来のクエン酸トランスポーターを運ぶプラスミドの存在によるものであることが判明している。^{[ 12 ]} 1982 年に Hall は、大腸菌の単一の自然発生的な Cit ⁺変異株を報告した。この変異株は、クエン酸も含む培養液中の別の新規物質での増殖を長期間選択している間に分離された。Hall の遺伝子解析では、根本的な変異は複雑であることが示されたが、彼は最終的に正確な変化や関与する遺伝子を特定することができず、隠れたトランスポーター遺伝子の活性化を仮説として立てた。^{[ 44 ]}ホールが変化の場所を絞り込むことができたゲノム領域は、 16年後に特定されたcitT遺伝子の既知の位置とは一致せず、ホールのCit ⁺変異体の輸送アッセイにおける生理学的特性も、CitTトランスポーターの好気性発現に期待されるものとは一致しなかった。^{[ 12 ] [ 45 ]}

2008年、ザカリー・D・ブラウント率いるレンスキーの研究チームは、ある集団においてクエン酸上で好気的に増殖する能力が進化したことを報告した。約33,127世代目、Ara-3と名付けられた集団において濁度の劇的な増加が観察された。研究チームは、この集団にクエン酸上で好気的に増殖できるクローン（Cit ⁺）が存在することを発見した。この代謝能力により、培地中に多量のクエン酸が存在するため、集団は以前よりも数倍大きく増殖することができた。集団の凍結化石サンプルを調べたところ、Cit ⁺クローンは31,500世代という早い時期から分離できることがわかった。集団内のCit ⁺変異体は、Ara-3集団に特有の多数の遺伝子マーカーを持っていることが判明した。この観察結果から、クローンが自然発生的な突然変異体ではなく、汚染物質である可能性は排除された。集団の歴史のさまざまな時点で凍結されたサンプルから分離されたCit ⁻クローンから Ara-3 の進化のテープを「再生」する一連の実験で、クエン酸上で好気的に増殖する能力は、遺伝的に純粋な進化クローンのサブセットで再進化する可能性が高いことが実証されました。これらの実験では、19 の独立した新しい Cit ^{+再進化の事例が観察されましたが、それは 20,000 世代以降に分離されたクローンから開始した場合に限られました。変動テストでは、この世代以降のクローンは、祖先よりも有意に高い Cit +}形質への突然変異率を示しました。これらの後のクローンでも、Cit ⁺への突然変異率は、1 兆回の細胞分裂あたり 1 回程度でした。^{[ 9 ]}

^{レンスキーとその同僚は、この1つの集団におけるCit +}機能の進化は、1つ以上の以前の、おそらく非適応的な「増強」突然変異によって生じ、突然変異率がアクセス可能なレベルまで上昇したと結論付けた。データは、クエン酸の使用には、これらの「増強」突然変異に続く少なくとも2つの突然変異が関与していることを示唆した。より一般的には、著者らは、これらの結果は、スティーブン・ジェイ・グールドの議論に従って、「歴史的偶然性が進化の過程に深く永続的な影響を与える可能性がある」ことを示していると示唆している。^{[ 9 ]}これらの発見は、歴史的偶然性が進化に及ぼす影響の重要な事例とみなされるようになった。^{[ 20 ] [ 46 ] [ 47 ]}

^{2012年、レンスキーとそのチームは、Cit +}形質のゲノム解析の結果を報告し、その形質の遺伝的基盤と進化の歴史を明らかにした。研究者らは、Ara-3 集団の歴史のさまざまな時点から分離された 29 個のクローンの全ゲノムをシーケンスした。彼らはこれらの配列を使用して集団の系統発生の歴史を再構築した。この再構築により、集団は20,000 世代までに3 つのクレードに分化したことが示された。Cit ^{+変異体はこれらのうちの 1 つで進化しており、彼らはそれをクレード 3 と呼んだ。以前の研究で増強されていることが判明したクローンは、3 つのクレードすべてに分布していたが、クレード 3 で過剰に存在していた。このことから、研究者らは、Cit + の}進化には少なくとも 2 つの増強変異が関与していたと結論付けた。^{[ 10 ]}

研究者らはまた、すべての Cit ⁺クローンに、2933 塩基対の DNA セグメントが重複または増幅された変異があることを発見した。重複したセグメントには、クエン酸上での嫌気性増殖に使用されるクエン酸トランスポータータンパク質のcitT遺伝子が含まれていた。重複はタンデムで、互いにヘッド トゥ テールの形でコピーが生成された。この新しい構成により、以前はサイレントで発現していなかったcitTのコピーが、酸素が存在するときに発現を指示する隣接するrnk遺伝子のプロモーターの制御下に置かれた。この新しいrnk-citTモジュールは、 citTの新規な制御パターンを生み出し、酸素が存在するときにクエン酸トランスポーターの発現を活性化し、それによってクエン酸上での好気性増殖を可能にした。^{[ 10 ]}

このrnk-citTモジュールを増強されたCit−クローン^のゲノムに組み込むことで、Cit ⁺表現型が得られることが示された。しかし、重複によって最初に得られたCit ^{+表現型は非常に弱く、約1%の適応度向上しか得られなかった。研究者らは、細菌がクエン酸上で良好に増殖できるよう、Cit +形質を十分に強化するには、} rnk-citTモジュールのコピー数を増やす必要があることを発見した。Cit ⁺細菌が集団内で優勢になった後も、さらなる変異によってクエン酸上での増殖がさらに向上した。

^{研究者らは、Cit +}形質の進化は 3 つの明確な段階を経て起こったと結論付けた。(1) Cit ⁺への突然変異率を高める突然変異が蓄積し、(2) 形質自体が弱い形で現れ、(3) その後の突然変異によって形質が改良された。Blount らは、このパターンは一般的に新しい形質がどのように進化するかの典型例である可能性があり、進化的革新の 3 段階モデル​​を提案した。

1. 潜在化：遺伝的背景が進化し、ある形質が突然変異によって発現しやすくなり、その形質の進化が可能になる。
2. 現実化：突然変異が起こり、その形質が発現するが、おそらく弱い形で現れる。
3. 改良：いったん形質が存在すると、それが選択的に有利であれば、形質を改善し効果的なものにする突然変異が蓄積されます。この段階は終わりがなく、改良突然変異が発生し、形質が有益である限り続きます。^{[ 10 ] [ 20 ]}

このモデルは進化生物学で受け入れられています。2015年に古生物学者のダグラス・アーウィンは、進化的新奇性と進化的革新性の違いをよりよく反映し、環境条件の重要性を強調するために、4段階モデル​​の修正を提案しました。それは、潜在化、新しい表現型の生成（現実化）、適応的洗練、および利用（新奇性が、それを所有する生物の生態学的確立にとって重要になったときに革新性に変換されること）です。^{[ 49 ]}

2014年、テキサス大学オースティン校のジェフリー・バリック研究室のエリック・クアント率いる研究チームは、 Cit + を進化させた Ara-3 系統に存在する 70 個の変異の中から、増強変異を特定するために、再帰的ゲノムワイド組換えおよびシーケンス (REGRES ⁾と呼ばれる新しい技術の適用について説明した。^{[ 50 ]}この方法は、33,000 世代の Cit ⁺クローンである CZB154 と LTEE の Cit ^{−創始クローンとの間で}F プラスミドベースの接合を行うプロセスを複数回実行し、Cit ⁺形質の弱い形態または強い形態の発現に必要でない変異を除去した。後者は Cit ^{++と呼ばれている。彼らは、Cit +}への表現型スイッチに関与するrnk-citTモジュールが、祖先において弱い Cit ⁺表現型を生成するのに十分であることを発見した。彼らはまた、Cit ⁺の初期進化後に CZB154 に至る系統で発生した変異を特定した。この変異は、 rnk-citTモジュール以外の変異を持たない祖先において、強い Cit ^{++表現型を付与した}。dctAと呼ばれる遺伝子の調節領域で見つかったこの変異は、 C ₄ -ジカルボン酸を細胞内に取り込む機能を持つDctA トランスポーターの発現を大幅に増加させた。この DctA 発現の増加により、Cit ^{+細胞は、クエン酸の取り込み中に CitT トランスポーターによって培地中に放出された}コハク酸、リンゴ酸、およびフマル酸を再取り込みできることがわかった。彼らは、Ara-3 集団の Cit ⁺⁺クローンで同様の変異を特定した。この変異は、祖先クローンで不活性化されていたDctA を調節する遺伝子dcuSの機能を回復させることで、DctA の発現を増加させた。Quandt らdctA変異は増強ではなく、改良に関与していると結論付けた。このことから、Ara-3集団におけるCit ^{+の進化は、初期の弱いCit +}変異体が改良変異が生じるのに十分な期間集団内に存続し、クエン酸上での増殖が顕著な適応度上の利点をもたらすほど強くなることを可能にする遺伝的背景と集団特有の生態に依存していた可能性があると示唆した。

^{クアントらは後に、Cit +}進化を促進する変異を決定的に特定した研究結果を発表した。 ^{[ 51 ]}この変異は、クエン酸回路への炭素の流れに関与する酵素であるクエン酸シンターゼをコードするgltA遺伝子にあった。この変異はクエン酸シンターゼ活性を増加させる効果があり、酢酸上での成長を改善できることを示した。さらに、gltA変異があると、Cit ^{+形質を引き起こす}rnk-citTモジュールは中立からわずかに有益な適応度効果を持つが、変異がない場合、このモジュールは強く有害であった。したがって、 gltA変異は、初期の弱いCit ⁺変異体が、後の改良変異が起こるまで集団内に存続することを可能にしたようで、これは彼らの以前の結論と一致している。強いCit ⁺⁺表現型が進化した後、増加したクエン酸シンターゼ活性は有害になった。研究者らは、gltA遺伝子のその後の変異が最初の変異を打ち消し、クエン酸シンターゼ活性を低下させ、クエン酸上での増殖をさらに促進したことを発見した。彼らは、 gltA遺伝子の一連の変異がまずクエン酸上での増殖を促進し、次にそれを洗練させたと結論付けた。また、Cit ^+が出現した系統は、酢酸上での増殖に基づいてAra-3株の中でニッチを占めていた可能性があり、Ara-3株におけるCit ⁺の進化につながった促進変異は、もともと酢酸利用に適応したものであった可能性を示唆した。

クエン酸上で増殖できない、別の系統群に属するCit ⁻細胞の小さな亜集団は、 Cit ⁺細胞が優勢になった後も集団内に残存した。初期の研究では、この多様性は、Cit ⁻細胞が培地中のグルコース上でより良く増殖できることが一因であることが示された。^{[ 9 ]} Turner らは後に、共存のもう 1 つの要因は、Cit ^{−細胞が多数派の Cit +}細胞から栄養を相互に摂取する能力を進化させたことであると発見した。彼らは、Cit ⁺細胞がクエン酸上で増殖する際に、CitT トランスポーターがこれらの物質を細胞外に排出し、同時にクエン酸を細胞内に送り込むため、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸を放出することを示した。Cit ⁻細胞は、祖先では不活性であった適切なトランスポータータンパク質の発現を回復させる突然変異により、これらの物質上で増殖する能力を急速に進化させていた。^{[ 52 ]}

Cit−^サブポピュレーションは、43,500～44,000世代の間に集団内で最終的に絶滅した。この絶滅は、Cit ^{+多数派がCit−}少数派が占めていたニッチに侵入できるように進化したことによるものではないことが示された。実際、 ^Cit−クローンは絶滅イベント後からCit ⁺集団に侵入することができた。さらに、絶滅の500世代前に凍結保存されたサンプルからAra-3集団の20個の複製を再開する実験で、Turnerらは、500世代の進化後、いずれの複製においてもCit−サブポピュレーションが絶滅していないことを発見した^。これらの複製の1つは2,500世代にわたって継続され、その間Cit−は^{共存し続けた。研究者らは、 Cit−}の絶滅は、自然集団に影響を与える可能性のあるものと同様の、未知の「まれな環境撹乱」によるものであると結論付けた。^{[ 53 ]}最後の複製はメインのLTEE実験に組み込まれ、13番目の集団であるAra-7となった。^{[ 54 ]}

バリー・ホールは1982年に好気性クエン酸利用大腸菌の変異株をすでに分離しており、その原因はgalオペロンにリンクしているcitAとcitB遺伝子の2つの変異にあると考えた。 ^{[ 55 ]}ホールの発見をCit+変異体の意図しない「直接選択」と対比させ、レンスキーの発見をCit+変異体の意図しない遺伝的「スクリーニング」とみなす者もいる。^{[ 56 ]}他の研究者たちは好気性クエン酸利用大腸菌の進化について実験を行っている。ダスティン・ヴァン・ホフウェゲンらは、飢餓下での非常に長い選択を用いることで、わずか12～100世代で46個の独立したクエン酸利用大腸菌変異体を分離することに成功した。この間、細菌はより多くの変異をより迅速にサンプリングすることになる。^{[ 56 ]}彼らの研究では、ゲノムDNAシーケンス解析により、 citTおよびdctA遺伝子座の増幅とDNAの再編成が、リチャード・レンスキーとそのチームが行った実験で確認された変異と同じクラスであることが明らかになった。彼らは、レンスキーの研究におけるクエン酸利用変異体の希少性は、独自の進化的種分化イベントではなく、彼のチームが使用した選択的な実験条件の結果である可能性が高いと結論付けた。^{[ 56 ]}

ジョン・ロスとソフィー・マイスニエ＝パティンは、レンスキーチームの遅延変異とヴァン・ホフウェーゲンチームの大腸菌に対する急速変異の両方のアプローチを検討した。彼らは、両チームが同様のCit ⁺変異体につながる増強、実現、および改良の同じシーケンスを観察したと主張している。^{[ 57 ]}彼らによると、レンスキーのクエン酸使用が選択される1日未満の期間、それに続く100倍希釈、そしてクエン酸使用が選択されないグルコース上での増殖期間により、最終的に大腸菌が1つの選択期間から次の選択期間にかけて初期の適応変異を蓄積できる確率が低下した。^{[ 57 ]}対照的に、ヴァン・ホフウェーゲンのチームは7日間の連続選択期間を設け、クエン酸を使用する大腸菌のより急速な発達をもたらした。 RothとMaisnier-Patinは、 LTEEの条件下での大腸菌の連続希釈とクエン酸利用の選択期間が短いことが、大腸菌の各世代が好気性クエン酸利用の次の段階に到達することを常に妨げていると示唆している。^{[ 57 ]}

レンスキーは、問題は実験やデータにあるのではなく、ヴァン・ホフウェーゲンらとマイスニエ＝パティンとロスによる解釈にあると主張している。^{[ 58 ]彼によれば、Cit +}の急速な進化は、彼のチームもリプレイ実験中に数週間で複数の Cit ⁺変異体を作り出すことができたため、必ずしも予想外ではなかったという。 ^{[ 59 ]彼は、LTEE はクエン酸利用変異体を分離したり、プロセスであってイベントではない種分化に対処したりするために設計されたものではないと主張している。さらに、LTEE における Cit +}の進化は、以前に蓄積された変異に依存していたと主張している。^{[ 59 ]}