循環腫瘍DNA

循環腫瘍 DNA (ctDNA) は、細胞に関連しない、血流中の腫瘍由来の断片化DNAです。ctDNAを、血流中を自由に循環しているが必ずしも腫瘍由来ではない DNA を表すより広い用語である細胞遊離DNA ( cfDNA ) と混同しないでください。ctDNA は腫瘍ゲノム全体を反映している可能性があるため、その潜在的な臨床的有用性に注目が集まっています。治療計画全体を通じて腫瘍の進行を監視するために、さまざまな時点で採血という形で「液体生検」を行うことができます。^{[1] [2]}

最近の研究では、cfDNA（およびctDNA）から遺伝子発現を推測するための基礎が築かれ、EPIC-seqが注目すべき進歩として浮上しました。^[3]この方法は、個々の遺伝子の発現レベルの非侵襲的推測の基準を大幅に引き上げ、それによって疾患の特徴付け、組織学的分類、および治療効果のモニタリングにおけるアッセイの適用性を高めました。^{[3] [4] [5]}

ctDNAは腫瘍から直接発生するか、または循環腫瘍細胞（CTC）^[6]に由来します。CTCとは、原発性腫瘍から剥がれ落ちて血流またはリンパ系に入る生存可能な無傷の腫瘍細胞を指します。ctDNA放出の正確なメカニズムは不明です。ctDNA放出に関与すると仮定されている生物学的プロセスには、死滅細胞のアポトーシスと壊死、または生存腫瘍細胞からの能動的な放出が含まれます。^{[7] [8] [9] [10] [11]}ヒト（健康および癌患者）^[12]と異種移植マウス^[13]の両方の研究によると、断片化されたcfDNAのサイズは主に166bpの長さであり、これはヌクレオソームに巻き付いたDNAとリンカーの長さに相当します。この長さの断片化はアポトーシスによるDNA断片化を示している可能性があり、アポトーシスがctDNA放出の主な方法である可能性を示唆しています。^{[14] [15]} 健康な組織では、浸潤食細胞がcfDNAを含むアポトーシスまたは壊死細胞残骸の除去を担っています。^[16]健康な患者のctDNAは低レベルでしか存在しませんが、癌患者では腫瘍のサイズが大きくなるにつれて、ctDNAのレベルが高くなることが検出されます。^[17]これは、腫瘍部位への免疫細胞の浸潤が不十分で、血流からのctDNAの有効な除去が減少するためである可能性があります。^[16] ctDNAと、同じ患者の原発性腫瘍から抽出したDNAの変異を比較すると、同一の癌関連の遺伝子変化が存在することが明らかになりました。^{[18] [19]}これにより、ctDNAを癌の早期発見と治療のフォローアップに使用できる可能性が生まれました。^[20]

血液をEDTAチューブに採取して保存すると、白血球が溶解し始め、ゲノム野生型DNAがサンプル中に放出されます。その量は、通常、ctDNAが存在する量より何倍も高くなります。^[21]これにより、変異やその他のctDNAバイオマーカーの検出が難しくなります。^[22]市販の細胞安定化チューブを使用すると、白血球の溶解を防止または遅らせることができるため、ctDNAの希釈効果を軽減できます。^[23] Sherwoodらは、EDTA K3チューブとStreck BCTチューブの両方で採取したサンプルで、KRAS変異の優れた検出を実証しました。 ^[23]細胞安定化チューブの利点は、血液をすぐに血漿に処理できない状況で実現できます。

他の手順でも「汚染」野生型DNAの量を減らし、ctDNAの検出をより実現可能にすることができる: ^[23]

• ctDNA分析のために血漿を抽出する前に血液サンプルを凍結しないでください
• サンプルを2～4時間以内に血漿に処理する（EDTAチューブに採取した場合）
• ヘパリン処理したチューブは絶対に使用しないでください。ヘパリンはDNAのらせん構造を模倣してPCRを阻害します。
• DNA 抽出の前に、より多くの細胞破片を除去するために、二重遠心分離ステップ (血液を遠心分離して血漿を抽出し、次に血漿に対して同じ操作を繰り返してチューブの底にある破片を除去する) を実行します。
• ctDNAの回収には血清よりも血漿のほうが優れている^[24]

ctDNA分析の主な魅力は、血液採取によって非侵襲的に抽出されることです。cfDNAまたはctDNAを取得するには、通常、約3mLの血液をEDTAでコーティングしたチューブに採取する必要があります。EDTAの使用は、血液凝固を減らすために重要です。血液の血漿分画と血清分画は、遠心分離ステップで分離できます。その後、これらの分画からctDNAまたはcfDNAを抽出できます。血清にはcfDNAのレベルが高い傾向がありますが、これは主にリンパ球由来のDNAによるものです。^[25] cfDNAの混入レベルが高いと、ctDNA検出の感度が低下する可能性があるため、最適ではありません。そのため、ほとんどの研究ではctDNAの分離に血漿を使用しています。次に、血漿を遠心分離で再度処理し、残っている無傷の血球を取り除きます。上清はDNA抽出に使用され、市販のキットを使用して実行できます。^[要出典]

抽出後の ctDNA の分析には、さまざまな増幅および配列決定法を使用する必要があります。これらの方法は、非標的アプローチですべての遺伝子を調べることが目的か、標的アプローチで特定の遺伝子と変異を監視することが目的かによって、主に 2 つのグループに分けられます。^{[引用が必要]}

全ゲノムまたは全エクソームシークエンシングアプローチは、疾患負荷のモニタリングや薬剤耐性の追跡中に腫瘍DNAの新しい変異を発見するために必要となる可能性がある。^[26]非標的アプローチは、腫瘍の異質性を観察したり、新しい薬剤ターゲットを発見したりする研究にも有用である。しかし、非標的法は特定の用途では必要となる可能性があるものの、より高価で解像度が低い。そのため、まれな変異や、ctDNAレベルが低い状況（微小残存病変など）を検出することが困難になる。さらに、全ゲノムアプローチを使用して腫瘍細胞のDNAと正常細胞のDNAを区別することが困難になる可能性がある。^[要出典]

全ゲノムまたはエクソーム配列決定では、通常、ハイスループットDNA配列決定技術が使用されます。代わりに、配列決定を全エクソームのみに制限すると、費用を削減し、速度を上げることができますが、DNAの非コード制御領域の変異に関する情報が失われるという代償があります。^[27]配列決定によってDNA多型を見るだけでは、DNAを腫瘍細胞や正常細胞と区別することはできませんが、この問題は、正常DNAのコントロールサンプル（たとえば、頬粘膜スワブで採取したDNA ）と比較することで解決できます。重要なのは、全ゲノムおよび全エクソーム配列決定は、初期の変異発見に役立つことです。これにより、より感度の高い標的技術を使用するための情報が得られ、その後、疾患のモニタリングに使用できます。

全ゲノム配列解析により、cfDNAの構造特性、断片のサイズ、断片化パターンを復元することができます。これらの固有のパターンは、ctDNAの検出を改善したり、これらの断片の起源組織を特定したりするための重要な情報源となり得ます。^[28] in vitroまたはin silico法による短い断片（<150bp）のサイズ選択により、突然変異やコピー数異常の復元が改善される可能性があります。^[15]

この方法はもともと、ジョンズ・ホプキンス大学のバート・フォーゲルシュタイン、ルイス・ディアス、ビクター・ベルクルエスクの研究室で開発されました。^[29]染色体を視覚化するために染料を使用して染色体バンドを染色する通常の核型分析とは異なり、デジタル核型分析では、コピー数変異を計算するためにゲノム全体の遺伝子座のDNA配列を使用します。^[29]コピー数変異は癌でよく見られ、遺伝子のヘテロ接合性の喪失が発現の低下による機能低下につながるか、遺伝子の重複が過剰発現につながる状況を指します。

イルミナHiSeqなどのハイスループットシーケンシング法を使用してゲノム全体を配列決定した後、染色体の再配列と転座を解析するために、再配列末端のパーソナライズ解析（PARE）をデータに適用します。この技術はもともと固形腫瘍DNAを解析するために設計されたものですが、ctDNAアプリケーション用に改良されました。^[29]

適切なエピジェネティックマーキングは正常な遺伝子発現と細胞機能に不可欠であり、エピジェネティックパターンの異常な変化は癌の特徴である。^[30]細胞内の正常なエピジェネティック状態は、少なくとも部分的にはDNA メチル化によって維持される。^{[31] ctDNA の異常なメチル化パターンの測定は、「} CpG アイランド」 と呼ばれる DNA 領域の安定したメチル化により可能になる。ctDNA のメチル化は亜硫酸水素塩処理によって検出できる。亜硫酸水素塩処理は、メチル化されていないシトシンを化学的にウラシルに変換し、メチル化されたシトシンは変更しない。その後 DNA を配列決定し、DNA メチル化パターンの変化を特定できる。DNA ヒドロキシメチル化も同様に関連するマークであり、癌を含む cfDNA における健康状態と病気の状態の予測マーカーであることが示されている。^{[32] [33]} )

標的アプローチでは、ctDNAの配列決定を、関心のある癌の変異ホットスポットに基づいて構築された遺伝子パネルに向けることができます。これは、薬物治療可能な標的で変異が特定された場合に治療を通知するために特に重要です。^[27]液体生検と標準的な一次組織生検を組み合わせることで、ctDNAの標的分析を各患者に個別化することもできます。一次腫瘍生検の全ゲノムまたは全エクソーム配列決定により、患者の腫瘍に特有の遺伝子変異を発見することができ、その後の患者のctDNAの標的配列決定に使用することができます。ctDNA検出の最高感度は、特定の一塩基多型（SNP）の標的配列決定によって達成されます。一般的にホットスポット変異を持つがん遺伝子などのよく変異する遺伝子は、標的配列決定アプローチの良い候補です。逆に、ほとんどの腫瘍抑制遺伝子は、遺伝子全体にわたって機能喪失変異の可能性のある広範な配列を持っているため、標的配列決定には適していません。^{[引用が必要]}

標的アプローチには、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはデジタルPCRを介してctDNAを増幅できるという利点があります。これは、血流中に循環しているDNAのレベルが比較的低いだけでなく、抽出された遊離DNA全体のうちctDNAが占める割合が小さいため、ctDNAを分析する際に特に重要です。^[27]したがって、関心領域の増幅によりctDNA検出の感度を大幅に向上させることができます。ただし、DNAポリメラーゼの固有のエラー率を考えると、PCRによる増幅ではエラーが発生する可能性があります。シーケンシング中に発生したエラーによっても、ctDNA変異の検出感度が低下する可能性があります。^[要出典]

ドロップレット デジタル PCR (ddPCR) は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応に由来し、ジョンズ ホプキンス大学のBert Vogelsteinのグループによって最初に命名されました。ドロップレット デジタル PCR では、油/水エマルジョンを使用して DNA の断片をドロップレットに分割するためにドロップレット ジェネレーターを使用します。次に、ctDNA の領域に対して選択されたプライマーを使用して、各ドロップレットで個別のポリメラーゼ連鎖反応が発生し、エンドポイントに進みます。目的の配列の存在は、増幅された領域に結合する蛍光プローブによって測定されます。ddPCR では、ctDNA の対立遺伝子および変異体の頻度を非常に定量的に評価できますが、1 つのアッセイで使用できる蛍光プローブの数 (最大 5 個) によって制限されます。^[34]アッセイの感度は、分析される DNA の量によって異なり、約 10,000 分の 1 です。^[34]特異性は、マイナー グルーブ結合 (MGB) 修飾プローブまたはロックされた核酸 (LNA) などの代替プローブの使用によって増強される必要があります。

ビーズ、乳化、増幅、磁気（BEAMing）は、ドロップレットデジタルPCRを基盤として、フローサイトメトリーを使用してctDNAの変異を特定する技術です。^[35]血液からctDNAを抽出した後、目的の領域をターゲットにするように設計されたプライマーを使用してPCRを実行します。これらのプライマーには、特定のDNA配列、つまりタグも含まれています。増幅されたDNAは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズと混合され、液滴に乳化されます。タグに結合するように設計されたビオチン化プライマーを使用してDNAを増幅します。ビオチン化により、増幅されたDNAは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに結合できます。PCRが完了すると、DNAが結合したビーズは磁石を使用して分離されます。次に、ビーズ上のDNAを変性させ、各DNAテンプレートに固有の蛍光オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせます。得られたビーズ-DNA複合体は、フローサイトメトリーを使用して分析されます。この技術は、ddPCRとの結合により、対立遺伝子および変異頻度を捕捉できます。しかし、ddPCRとは異なり、蛍光結合プローブを使用する柔軟性により、より多くのDNA配列を調べることができます。このシステムのもう1つの利点は、単離されたDNAを下流の配列決定にも使用できることです。^{[36]感度は104分}の1から105分の4.3です^。 [ 34 ^]

ディープシーケンシングによるがん個別化プロファイリング（CAPP-Seq）は、もともとスタンフォード大学のアッシュ・アリザデとマクシミリアン・ディーンのグループによって説明されました。この技術は、ビオチン化オリゴヌクレオチドセレクタープローブを使用して、ctDNA検出に関連するDNA配列をターゲットにします。^[37]公開されているがんデータベースを使用して、再発指数を計算することにより、がんの再発性変異に対するプローブのライブラリを構築しました。プロトコルは、ctDNAコレクションで観察された低いDNAレベルに合わせて最適化されました。次に、分離されたDNAはディープシーケンシングを受け、感度が向上します。この技術により、数百のDNA領域を調べることができます。CAPP-SeqのctDNA検出感度は、1,000,000個中2.5分子であると報告されています。^[38]

タグ付きアンプリコンディープシーケンシング（TAM-Seq）は、ctDNAの変異を検出するために遺伝子全体の標的シーケンシングを可能にします。^[39]まず、150〜200bpのセクションで目的の遺伝子全体に及ぶプライマーを使用して、一般的な増幅ステップを実行します。次に、マイクロ流体システムを使用して、各アンプリコンに固有の識別子を持つアダプターを取り付け、並列シングルプレックス反応でDNAをさらに増幅します。この技術は、進行性卵巣がん患者のTP53腫瘍抑制遺伝子に散在する変異を正常に識別できることが示されました。この技術の感度は50分の1です。

セーフシーケンシング（Safe-Seq）は、もともとジョンズホプキンス大学のバート・フォーゲルシュタインと彼のグループによって説明されました。Safe-Seqは、超並列シーケンシングのエラー率を下げて、まれな変異体に対する感度を高めます。^[40]これは、各DNAテンプレートに一意の識別子（UID）シーケンスを追加することで実現します。次に、追加されたUIDを使用してDNAを増幅し、シーケンスします。同じUID（UIDファミリー）を持つすべてのDNA分子は、1つの分子から増幅されたため、同じDNAシーケンスが報告されるはずです。ただし、増幅によって変異が導入されたり、シーケンスおよび分析の段階で誤った塩基割り当てが呼び出されたりする可能性があります。UIDの存在により、これらの方法論のエラーをctDNAの真の変異から分離できます。シーケンスされたリードの95％が一致する場合、変異は「スーパーミュータント」と見なされます。このアプローチの感度は100万分の9です。^[34]

デュプレックスシーケンシングは、Safe-Seq技術で追加された単一のUIDを改良したものです。^[41]デュプレックスシーケンシングでは、ランダム化された二本鎖DNAが固有のタグとして機能し、不変スペーサーに取り付けられます。タグはDNA断片の両端に取り付けられ（αタグとβタグ）、PCR用の2つの固有のテンプレートが生成されます。1つの鎖は5'末端にαタグ、3'末端にβタグがあり、もう1つの鎖は5'末端にβタグ、3'末端にαタグがあります。これらのDNA断片は、タグの不変配列に対するプライマーを使用して増幅されます。増幅されたDNAは配列決定され、分析されます。デュプレックスアダプターを持つDNAが比較され、両方の鎖間でコンセンサスがある場合にのみ変異が受け入れられます。この方法では、配列決定によるエラーと初期段階のPCR増幅によるエラーの両方が考慮されます。変異体を発見するこのアプローチの感度は 10^7 分の 1 です。

統合デジタルエラー抑制（iDES）は、ctDNAのCAPP-Seq分析を改善してエラーを減らし、検出感度を高めます。^[38] 2016年に報告されたiDESは、CAPP-Seqとデュプレックスバーコーディングシーケンス技術、およびCAPP-Seqハイブリダイゼーションステップに関連するステレオタイプのエラーを除去する計算アルゴリズムを組み合わせたものです。この方法では、可能な場合はデュプレックスシーケンスも統合し、細胞フリーDNAからより効率的にデュプレックスを回収する方法も含まれています。このCAPP-Seqの改良版の感度は、100,000コピー中4です。

治療抵抗性前立腺がん（大多数、場合によっては転移性）や膀胱がんのさまざまな患者、およびこの DNA を示さない対照患者に存在する ctDNA の全ゲノム配列解析調査が、ゲノムの体細胞変異や構造再編成を含めて実施されました。

この新しく有望な技術により、アンドロゲン受容体シグナル伝達阻害剤による治療に対する耐性、腫瘍内の異質性（系統進化と分子年代測定による）、染色体不安定性、全体的なトランスクリプトームパターンを通じたctDNAの転移への寄与（転写開始部位（TSS）とAR結合部位（ARB）に存在するヌクレオソームを考慮）に関する情報が得られました。このようにして、ctDNAのゲノムおよびトランスクリプトームの進化を観察することができ、治療に対する耐性が生じている生きた患者で実施できるため、ctDNAの配列決定は、がんの表現型における臨床的に関連する違いを特定し、治療が患者にどのように影響しているかを確認するために不可欠です。さらに、転移間のドライバー遺伝子の変化の相対的な均一性は、前立腺がんのゲノムおよび機能の変化がctDNAと組織間で共有されていることを正当化します。

これにより、ctDNA は転移性癌患者のゲノム規模での遺伝子変異の検出に強力な新ツールとなり、これらの腫瘍のクローン構成の臨床的関連性を観察して癌のコントロールを改善することができます。全ゲノム配列決定による ctDNA に基づくこのサブクローン再構築は、腫瘍学の科学研究に独自の課題と機会をもたらします。さらに、連続 ctDNA はデータの次元を増やすため、治療によるアンドロゲン受容体増強の選択を明らかにします。

転移部位と大きさが腫瘍量と関連して循環腫瘍DNAにどのように影響するか、また臨床的に優位な疾患を反映する他の病変を選択するための新しい技術の選択を理解するには、さらなる研究が必要である。^[42]

ctDNAを癌バイオマーカーとして使用する際の課題の1つは、ctDNAを正常細胞のcfDNAと区別できるかどうかである。cfDNAは、正常な細胞ターンオーバー中に非悪性細胞から放出されるが、手術、放射線療法、化学療法などの処置中にも放出される。血清中のcfDNAの主な原因は白血球であると考えられている。^[27]

原発性疾患の検出におけるctDNAの臨床的有用性は、ctDNAレベルが低く、事前に未知の体細胞変異を有する小さな腫瘍を検出する現在の技術の感度によって部分的に制限されている。^{[17] [34]}

腫瘍切除後、 CT、PET、MRIなどの従来の画像診断法では疾患の証拠が見つからない場合がある。そのため、従来の画像診断法では腫瘍塊が見つからない場合、 ctDNA分析は微小残存病変（MRD）を検出し、腫瘍再発の可能性を調べる潜在的な手段となる。 ^[17] CT画像診断によるMRD検出とctDNAの比較は、以前にもステージII大腸がん患者で実施されている。この研究では、研究者らはCTスキャンで臨床的悪性腫瘍の兆候を示さなかった患者でctDNAを検出できたことから、ctDNA検出の方がMRDを評価する感度が高いことが示唆された。^[27]しかし、著者らはctDNA分析に限界がないわけではないことを認めている。術後に採取した血漿サンプルでは、​​36か月後の再発を48%の症例でしか予測できなかった。^{[27]その後、ctDNAアッセイは}大腸がん^[43]と悪性黒色腫^[44]の両方で開発されている。

ctDNAの量や質の測定ががん患者の転帰を判定するのに使用できるかどうかという問題は、研究対象となってきた。2015年時点では、これは非常に不確実であった。^[45] いくつかの研究では、転移性がんのステージが高い人ではctDNAレベルが高くなる傾向があることが示されたが、ctDNAの量は必ずしも従来のがんのステージングと相関しているわけではない。^[34] 2013年時点では、ctDNAが予後の唯一の予測因子として臨床的に有用である可能性は低いようであった。^[46]

腫瘍内および腫瘍間の異質性による薬剤耐性腫瘍の出現は、治療効果における問題です。腫瘍内の小さな遺伝子クローンは、薬剤耐性変異を持っている場合、治療後に拡大する可能性があります。最初の生検では、腫瘍内の細胞の頻度が低いか空間的に離れているため、これらのクローンを見逃す可能性があります。たとえば、生検では腫瘍の小さな部分しかサンプルとして採取されないため、別の場所にあるクローンに気付かない可能性があります。これは、がんの進行と再発における腫瘍の異質性の役割を研究することに焦点を当てた研究に誤解をもたらす可能性があります。研究で ctDNA を使用すると、原発部位と転移部位の両方でがんの遺伝的多様性のより代表的な「スクリーンショット」を提供できるため、これらの懸念を軽減できます。たとえば、ctDNA は、治療レジメンの前後の患者のがんのクローン進化を研究するのに有用であることが示されています。^[47]がんの早期発見は依然として困難ですが、cfDNAのエピジェネティックな特徴の分析、または断片化パターンのロック解除における最近の進歩により、液体生検の感度が向上しています。^[28]さらに、ctDNA分析は、転移性腫瘍のクローン構成を理解し、ゲノム規模でさまざまな変異を検出し、さまざまな耐性表現型が見つかる可能性があるため、病気の予後に影響するサブクローンの多様性を研究し、治療に対するゲノムおよびトランスクリプトームの耐性の新しいメカニズムの出現を研究するための新しいツールです。^[42]

ctDNA の臨床実践への導入は、ctDNA の処理と分析の標準化された方法がないために大きく妨げられています。ctDNA 分析が日常的な臨床検査になるには、サンプル収集 (収集時間を含む)、下流処理 (DNA 抽出と増幅)、定量化、検証の方法の標準化を確立する必要があります。さらに、現在の ctDNA の配列決定と検出方法の解像度を考えると、「標準」腫瘍関連バイオマーカーのパネルの作成が必要になる可能性があります。血漿サンプルから腫瘍固有の異常を配列決定すると、分析から汚染された cfDNA を除外するのに役立つ可能性があります。正常細胞からの cfDNA レベルの上昇は、がんに関連しない原因に起因する可能性があります。^{[27]これらの配列決定技術は、がんのクローン進化、}腫瘍の異質性、がんに関与する薬剤耐性メカニズム を決定することもできます。^[42]

• 循環ミトコンドリアDNA
• 液体生検

• 循環腫瘍DNAメチル化を肺癌の診断に応用する 2019年5月
• 循環腫瘍 DNA: 新世代の癌バイオマーカー 2014 年 2 月
• ctDNA「液体生検」が癌治療に革命を起こす可能性 2014年11月
• カラチャリオ N、マイヨ デ ラス カサス C、モリーナ ビラ マサチューセッツ、ロセル R (2015 年 3 月)。 「がん治療においてリアルタイムリキッドバイオプシーが現実となる」。トランスレーショナル・メディシンの年報。3 (3): 36.土井:10.3978/j.issn.2305-5839.2015.01.16。PMC  4356857。PMID  25815297。
• Marusina, Kate (2018 年 2 月 8 日)。「循環腫瘍 DNA の抽出」。ClinicalOMICs。2018年3月 5 日閲覧。
• Du-Bois, Asante (2019)。「循環腫瘍DNAと細胞を用いた卵巣がんの液体生検：プライムタイムの準備は整っているか？」Cancer Letters . 468 :59–71. doi : 10.1016/j.canlet.2019.10.014 . PMID  31610267。
• NucPosDB: 生体内でのヌクレオソーム配置と遊離DNAのヌクレオソミクスのデータベース