シトルリン化

シトルリン化または脱イミノ化は、タンパク質中のアミノ酸 アルギニンがアミノ酸シトルリンに変換される反応です。シトルリンは、遺伝コードで DNA にコード化されている 20 種類の標準アミノ酸の 1 つではありません。代わりに、翻訳後修飾の結果です。シトルリン化は、尿素回路の一部として、または一酸化窒素合成酵素ファミリーの酵素の副産物として遊離アミノ酸シトルリンが形成されることとは異なります。

アルギニンデイミナーゼ（ADI）と呼ばれる酵素は、遊離アルギニンの脱イミノ化を触媒し、タンパク質アルギニンデイミナーゼまたはペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）は、主要なケチミン基（>C=NH）をケトン基（>C=O）に置き換えます。アルギニンは中性pHで正に帯電しますが、シトルリンは正味電荷を持ちません。これによりタンパク質の疎水性が高まり、タンパク質の折り畳みが変化し、構造と機能に影響を与える可能性があります。

免疫系はシトルリン化タンパク質を攻撃し、関節リウマチ（RA）や多発性硬化症（MS）などの自己免疫疾患を引き起こす可能性があります。フィブリンおよびフィブリノーゲンは、関節リウマチにおけるアルギニン脱イミノ化の好部位である可能性があります。抗シトルリン化タンパク質（ACP）抗体の存在を調べる検査は、関節リウマチに対して非常に特異性が高く（88～96％）、 RAの診断におけるリウマチ因子（70～78％）と同程度の感度があり、臨床疾患の発症前から検出可能です。^[1]

シトルリン化ビメンチンは、RAやその他の自己免疫疾患における自己抗原である可能性があり、RAの研究に使用されています。さらに、変異したシトルリン化ビメンチン（MCV）に対する抗体は、RA治療の効果をモニタリングするために有用である可能性があります。^[2] ELISAシステムは、検査の性能を向上させるために、ビメンチンの天然アイソフォームである遺伝子組み換えシトルリン化ビメンチン（MCV）を使用します。^[3]

アルギニンからシトルリンへの反応では、アルギニン側鎖の末端窒素原子の 1 つが酸素に置き換えられます。したがって、アルギニンの正電荷 (生理学的 pH で) が除去され、タンパク質の三次構造が変化します。この反応では 1 つの水分子が使用され、副産物として アンモニアが生成されます。

PADは脊索動物に見られるが、下等動物には見られない。哺乳類では5つのPADアイソタイプ（PAD1、PAD2、PAD3、PAD4、PAD6）が見つかっている。^[4] PAD5はヒトに特有のアイソタイプだと考えられていたが、PAD4と相同性があることが示された。^[4]これらのアイソタイプは組織や細胞分布の点で異なる。

PAD1の発現は表皮と子宮で検出されており、ケラチノサイトの主要成分であるケラチンとフィラグリンのシトルリン化に作用する。^[4]

PAD2は、眼や脳、骨格筋、脾臓を含む中枢神経系（CNS）で高レベルで発現しています。PAD転写産物は、胎生14.5日目の早い段階でC57BL6/Jマウスの眼で発見されています。 ^{[5] PAD2は骨格筋やマクロファージの}ビメンチンと相互作用してフィラメントを分解させることも示されており、アポトーシスにおける役割を示唆しています。^[4]

PAD2の標的基質の1つは、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）です。正常な網膜では、光受容体を含むほぼすべての網膜層で脱イミノ化が見られます。脱イミノ化は、アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、ニューロンなどの神経細胞でも報告されています。^[6] MBPのメチル化とリン酸化は、ミエリン形成の過程で活発に行われます。胎児の初期のCNS発達では、MBPの脱イミノ化がミエリンの組み立てに大きな役割を果たします。成人では、多発性硬化症などの脱髄疾患でMBPの脱イミノ化が見られます。MBPは、それぞれの場合で異なる細胞タイプに影響を与える可能性があります。^[7]

PAD3の発現は羊毛の変性と関連している。トリコヒアリンのシトルリン化により、ケラチンフィラメントに結合して架橋し、羊毛繊維の成長を誘導する。^[4]

PAD4 はヒストン修飾を通じて遺伝子発現を制御します。DNA はヒストンに巻き付いており、ヒストンタンパク質は化学基の追加や除去によって DNA 発現を制御できます。このプロセスは、DNA が翻訳された後にタンパク質上で行われるため、翻訳後プロセシングまたは翻訳後修飾として知られています。遺伝子制御における翻訳後プロセシングの役割は、成長を続ける研究分野であるエピジェネティクスの主題です。修飾メカニズムの 1 つはメチル化です。メチル基 (CH ₃ ) がヒストンタンパク質のアルギニンに結合し、ヒストンへの DNA の結合を変えて転写を可能にします。PAD がヒストンのアルギニンをシトルリンに変換すると、ヒストンのさらなるメチル化がブロックされ、転写が阻害されます。^{[8] [9]}この主なアイソタイプはPAD4であり、ヒストン3と4上のアルギニンおよび/またはモノメチル化アルギニンを脱イミノ化し、アルギニンメチル化の効果をオフにします。^[10]

関節リウマチや、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群などの他の自己免疫疾患では、自己抗体がシトルリン化タンパク質を攻撃することがよくあります。抗シトルリン化タンパク質抗体の存在は関節リウマチの標準的な検査であり、より重篤な疾患と関連しています。シトルリン化タンパク質は、アルツハイマー病の細胞破壊に伴う細胞残骸や、喫煙後にも見られます。そのため、シトルリン化は自己免疫疾患で免疫系を刺激するメカニズムの一部であると思われます。ただし、シトルリン化タンパク質は健康な結腸 粘膜にも見られます。^{[11] [12] [13] [14] [15] [16]}

脱イミノ化に関する最初の包括的な教科書は2014年に出版されました。^[17]

シトルリン化されたペプチドおよびタンパク質は、シトルリン化された残基を標的とする抗体を使用して検出するか、質量分析法に基づくプロテオミクス技術を使用して検出できます。アルギニンのシトルリン化により、+0.984016 Daのモノアイソトピック質量増加が生じ、これは質量分析法で測定できます。質量シフトは、特に低解像度の機器ではシトルリン化されたペプチドと間違われる可能性がある、異なるペプチド同位体間の質量差+1.008665に近くなります。ただし、これは現代の高解像度/高精度の質量分析計ではそれほど問題になりません。さらに、質量シフトは、一般的な修飾であるアミノ酸アスパラギンまたはグルタミン側鎖の脱アミド化によって引き起こされる質量シフトと同一です。

シトルリン残基は分析前にブタンジオンまたはビオチン化によって化学的に修飾することができ、異なる質量シフトをもたらし、この戦略は質量分析による同定を容易にするために効果的に使用されてきた。^{[18] [19]}

もう一つのアプローチは、質量分析計で低エネルギー衝突誘起解離フラグメンテーションを受けると、シトルリン残基からイソシアン酸（HNCO）の中性損失を利用することである。この損失は-43.0058 Daの質量シフトを引き起こし、質量分析計はこれを利用して主にシトルリン化ペプチドをフラグメンテーション（配列決定）のために選択することができる。^{[20] [21]}

最後に、生理的 pH でのシトルリン化による正電荷の損失を利用することができます。ボトムアップ プロテオミクス分析の前に、タンパク質は酵素的にペプチドに切断されます。一般的には、正電荷を帯びたアルギニンおよびリジン残基の後で切断するプロテアーゼ トリプシンが使用されます。ただし、トリプシンは中性のシトルリン残基の後で切断することはできません。シトルリン残基の後で切断されなかったことと正しい質量シフトは、シトルリン化の特異的かつ高感度なマーカーとして使用でき、この戦略は標準的なボトムアップ プロテオミクスワークフローと互換性があります。