ベータプロペラフィターゼ

BPP（PDBID：3AMR）。触媒的に重要なカルシウムイオン4～8は緑色で、それほど重要ではないと思われるカルシウムイオン1～3と9～11はマゼンタ色で示されています。^[1] N末端とC末端、プロペラの「ブレード」、活性部位に結合したミオイノシトールヘキサ硫酸（IHS、フィチン酸類似体）が図に示されています。

β-プロペラフィターゼ（BPP ）は、円形のβ-プロペラ構造を持つ酵素群（タンパク質スーパーファミリー）です。BPPはフィターゼであり、フィチン酸とそのフィチン酸塩からリン酸基を除去（加水分解）することができます。 ^[2]加水分解は段階的に起こり、通常、3つのリン酸基が結合したままのミオイノシトール三リン酸生成物で終わります。 ^[3] BPPの実際の基質はフィチン酸カルシウムであり^[4]、これを加水分解するためには、BPPはCa ²⁺イオンを結合している必要があります。BPPは環境中で最も広く見られるフィターゼスーパーファミリーであり、土壌と水中のフィチン酸-リン循環において主要な役割を果たしていると考えられています。^[5]別名アルカリフィターゼが示すように、BPPは塩基性（または中性）環境で最もよく機能します。最適pH値は6～9であり^[2] 、これはフィターゼの中では独特である。^[5]

2018 年 4 月現在、BPP は商業的に使用されていませんが、商業的に使用される可能性はあります。ヒスチジン酸性フィターゼ (HAP) は、現在動物飼料に使用されている唯一のフィターゼ グループです。

農業では、単胃動物の飼料に、飼料の栄養素の生物学的利用能を高めるために、組み換えフィターゼが一般的に添加されている。^[6]これらの栄養素には、リン酸基の形でフィチン酸に結合しているリンが含まれる。牛などの反芻動物とは対照的に、豚や鶏などの単胃動物の腸内細菌は、動物の消化器系がリンを利用できるように、これらの基を適切に加水分解することができない。吸収されなかったリンはこのように無駄になり、農業用排水を介して動物の堆肥中に混入して環境に放出され、富栄養化を引き起こす可能性がある。フィチン酸は、抗栄養素としても働く可能性がある。飼料中のカルシウムをキレート化し、飼料中のカルシウム含有量の最大60～70%まで生物学的利用能を低下させる可能性がある。フィターゼを添加すると、カルシウムの利用能が向上し、鉄と亜鉛の生物学的利用能も向上する。銅とマンガンの利用能も高まる可能性がある。アミノ酸の生物学的利用能は大幅に向上しない。^[7]

65℃を超える温度では不安定になることが多いヒスチジン酸性フィターゼ（HAP）と比較して、BPPは80～85℃の高温に自然に耐えることができます。このような温度は、動物飼料の製造中にペレット化する際によく使用されます。HAPとは異なり、BPPは中性またはアルカリ性の最適pH値を持つため、中性またはアルカリ性の環境で使用することができます。これにより、フィターゼの潜在的な用途が広がります。 ^[2]魚やエビなど多くの動物は中性またはアルカリ性の消化管を持っているため、BPPは水生動物の飼料に使用できます。^[8] BPPはHAPとは異なり、フィチン酸に特異的です。^{[5] HAPは、} ADP、GTP、NADHなどの他のリン酸含有分子も加水分解します。^[9]しかし、BPPは、現在のHAPよりも触媒的に2～60倍以上遅いです。 HAPの比触媒活性は100～3000 U mg ^{−1です。BPPの比触媒活性は通常50 U mg −1}未満です。^[2]このように活性が低いため、BPPの実用化にはさらに多くの研究が必要です。^[5]

2018 年 4 月現在、BPP の結晶構造は7 つ知られています: 3AMR、3AMS、1H6L、1POO、2POO、1CVM、1QLG。

既知の BPP の質量はおよそ 35～68 kDaです。[ ^5]ドーナツ型の β プロペラ構造は、6 つの平行なβ シート構造または「ブレード」で構成されています。これらのブレードの 1 つには 5 つの β シート (この記事の冒頭の図のブレード番号 5) があり、残りのブレードには 4 つの β シートがあります。これらのブレード間には疎水性相互作用があり、プロペラ構造をまとめていると考えられています。これらのブレードは、酵素を貫通するトンネルのような穴を形成します。このトンネルには、いくつかの水分子が結合します。トンネルの前には、結合するCa ²⁺イオンと特定の正のアミノ酸残基により、全体として正に帯電している酵素の活性部位があります。この部位は、負に帯電したフィチン酸カルシウムと結合し、そこからリン酸を加水分解します。^[2]

2008 年の Huang らによる研究では、66 個の BPPペプチド配列を比較し、研究したすべてのBPP で配列モチーフDA[A/T/E]DDPA[I/L/V]W と NN[V/I]D[I/L/V]R[Y/D/Q] が保存されていることがわかりました。たとえば、R[Y/D/Q] は、配列にRとY、D、またはQ が含まれていること、つまり RY、RD、または RQ を意味します。 ^[10] Kumar らによる 2014 年の研究では、44 個の BPP を比較し、10 個のモチーフが見つかりました。そのうちの 2 つ、DDPAIW[VI][HN]PK[DN]P[ESA]KS と NN[F/V]D[I/V/L] は、研究したすべての BPP で見つかりました。これらは、2008 年の Huang らによる研究で見つかったものと類似していることが指摘されました。^[5]

BPP はカルシウム依存性金属タンパク質です。その活性部位には、負に帯電したアミノ酸カルボキシレート基を介して結合した多数のカルシウム陽イオン (Ca 2+ )があります。負に帯電したフィチン酸を電気的に有利に結合するには、正のカルシウムイオンが必要です。結合は、フィチン酸の負に帯電^したリン酸基と、フィチン酸に直接結合する BPP の特定の正のアミノ酸残基を介して起こります。^[1] Ca ^{2+濃度も BPP の最適}pHと熱安定性に影響します。たとえば、Bacillus sp . KHU-10 BPP では、60 °C および pH 6～9.5 で 10 mMのCaCl 2 を添加すると_活性が最高になります。CaCl ₂を添加しない場合、pH が最高になるのは 40 °C および pH 6.5～8.5 のときです。^[5]

Ca ²⁺を除去すると触媒活性が失われるため、Ca 2+^を キレートする EDTA はBPP を阻害します。カルシウム結合アミノ酸の特定の点突然変異も酵素機能を停止します。Cd ²⁺、Mn ²⁺、 Cu ²⁺、Ba ²⁺、Hg ²⁺、Zn ²⁺、Co ²⁺、Fe ²⁺などの二価イオンは、酵素内のCa ^{2+ を}置き換えることで BPP を阻害します。 ^{[5]これはおそらく、これらの陽イオンが、}ファンデルワールス半径(WDV) が 0.99 Åの Ca ²⁺イオンに比べて小さすぎるためです。たとえば、Co ^{2+の VDW は 0.74 Å であるため、Ca 2+}と同じタスクを実行するには小さすぎる可能性があります。ただし、Sr ²⁺イオンは、少なくとも特定のケースでは、触媒機能を完全に失うことなくCa ^{2+ を}置き換えることができます。 Sr ²⁺ VDW半径は1.12Åで、Ca ²⁺の半径とほぼ同じです。^[4]異なるイオン間の同様の適合性は、他の酵素でも見られます。^[11]

高Ca ²⁺濃度は、BPP触媒速度を限界まで高めることができます。Ca ²⁺濃度がこの限界を超えると、余分なCa ^{2+イオンが}競合阻害剤として働き始めます。Ca ²⁺に結合していない高濃度の遊離フィチン酸もBPPを阻害します。これは、BPPに結合したCa ²⁺の遊離フィチン酸を介したキレート化を介して起こる可能性があります。^[4]

その他のタイプの阻害剤には、オキシアニオン（酸素結合性）モリブデン酸塩、タングステン酸塩、バナデートなどがある。これらのオキシアニオンによる阻害は、酵素の活性部位内で三方両錐体錯体を形成するため起こると考えられており、この錯体は加水分解中のフィチン酸のリン酸基の遷移状態に似ている。フィチン酸から遊離するオルトリン酸は、BPPの競合阻害剤として機能する。 ^[9]フィチン酸類似体ミオイノシトールヘキサ硫酸塩（IHS）はBPPを阻害し、フィチン酸との類似性からBPPの構造研究の補助として使用されている（3AMRを参照）。^[2]

2001 年に Shin らが提案した加水分解メカニズムでは、 BPP に結合したCa ²⁺イオンは加水分解イオンと親和性部位イオンに分けられます。加水分解部位では、Ca ^{2+ が}除去されようとしているリン酸が活性部位に結合するのを助けます。また、加水分解に関与する水分子を活性化してOH ⁻イオンに変え、触媒反応中の遷移状態を安定化します。親和性部位イオンは活性部位へのフィチン酸の親和性を高め、加水分解中にフィチン酸を他のリン酸基から動かないようにします。加水分解は段階的に繰り返され、3つのリン酸を持つミオイノシトール生成物が得られます。^[3]他の研究では 3 つのリン酸を持つ生成物が支持されていますが、^{[12] [13] [14] [15]}、BPP 濃度が高く、インキュベーション時間が長いなどの極端な条件下では、より多くのリン酸が除去される可能性があります。^[13]

Shinらが示唆した実際の加水分解は2段階で起こる。2段階目は遅く、全体の反応速度を制限します。最初の段階では、カルボニル基がリン酸のリンから電子を引き抜き、リン酸を電子不足、つまり正電荷のままにします。同時に、OH ^{− は}リン酸の名目上正電荷のリンに電子対を供与します。三方両錐の中間状態が形成されます。2段階目では、酸性アミノ酸残基（BH ⁺）が結合中の酸素にプロトンを供与すると、リン酸エステル結合が切断されます。こうしてリン酸基が切断されます。^[3]

複数の加水分解経路が提案されていますが、どれが正しいのか、あるいは複数の経路が存在するのかは不明です。これらの加水分解経路を以下にまとめます。

• エンバイロピッグ
• 3-フィターゼ
• 4-フィターゼ
• 5-フィターゼ
• キシラナーゼ