トランスポゾン変異誘発

Tn5トランスポゾンシステムは、転移の研究およびトランスポゾン変異誘発の応用のためのモデルシステムです。Tn5は、遺伝子（抗生物質耐性遺伝子を含む元のシステム）が、トランスポゾンの右側と左側にそれぞれ対応するIS50RとIS50Lというほぼ同一の2つの挿入配列に挟まれた細菌複合トランスポゾンです。 ^{[ 6 ]} IS50R配列は、TnpとInhという2つのタンパク質をコードしています。これらの2つのタンパク質は、InhがN末端の55アミノ酸を欠いているという事実を除いて、配列が同一です。Tnpはシステム全体のトランスポザーゼをコードし、Inhはトランスポザーゼの阻害因子をコードしています。TnpのDNA結合ドメインはN末端の55アミノ酸に存在するため、これらの残基は機能に不可欠です。^{[ 6 ]} IS50R および IS50L 配列は、トランスポゾンの内側と外側の両端にそれぞれ IE および OE とラベル付けされた19塩基対の要素によって挟まれています。これらの領域の変異により、トランスポザーゼ遺伝子が配列に結合できなくなります。トランスポザーゼとこれらの配列間の結合相互作用は非常に複雑で、 DNA メチル化やその他のエピジェネティックマークの影響を受けます。^{[ 6 ]}さらに、DnaA などの他のタンパク質も IS50 要素に結合してその転移に影響を与えることができるようです。

Tn 5 転移の最も可能性の高い経路は、すべてのトランスポゾンシステムに共通する経路です。まず、Tnp が各 IS50 配列の OE および IE 配列に結合することから始まります。両端が合わさり、 DNA のオリゴマー化によって、配列が染色体から切り出されます。標的 DNA に 9 塩基対の5' 末端を導入した後、トランスポゾンとその組み込まれた遺伝子が標的 DNA に挿入され、トランスポゾンの両端の領域が複製されます。^{[ 6 ]}目的の遺伝子は、 IS50 配列の間にトランスポゾンシステムに遺伝子操作によって組み込むことができます。トランスポゾンを宿主プロモーターの制御下に置くことで、遺伝子が発現します。組み込まれた遺伝子には、通常、目的の遺伝子に加えて、形質転換体を識別するための選択マーカー、真核生物プロモーター/ターミネーター(真核生物で発現する場合)、およびポリシストロン配列内の遺伝子を分離するための3' UTR配列が含まれます。

スリーピングビューティートランスポゾンシステム（SBTS）は、脊椎動物のゲノムに遺伝子カセットを組み込むための最初の成功した非ウイルスベクターです。このシステムが開発されるまで、非ウイルス遺伝子治療の主な問題は、原核生物として認識されることによるトランスジーンの細胞内分解と、臓器系へのトランスジーンの非効率的な送達でした。SBTSは、ウイルスと裸のDNAの利点を組み合わせることで、これらの問題に革命をもたらしました。これは、発現する遺伝子のカセットと独自のトランスポザーゼ酵素を含むトランスポゾンで構成されています。プラスミドから生物のゲノムにカセットを直接転移させることで、トランスジーンの持続的な発現を達成できます。^{[ 2 ]}これは、トランスポゾン配列と使用するトランスポザーゼ酵素を強化することでさらに改良できます。SB100Xは、典型的な第一世代トランスポザーゼよりも約100倍効率的な超活性哺乳類トランスポザーゼです。この酵素をカセットに組み込むことで、トランスジーンの発現がさらに持続する（1年以上）。さらに、マウスの受精卵に前核注入を用いると、トランスジェネシスの頻度は45%にも達する可能性がある。^{[ 7 ]}

SBTSのメカニズムはTn5トランスポゾンシステムに似ていますが、酵素と遺伝子配列は原核生物ではなく真核生物由来です。このシステムのトランスポザーゼはトランスでもシスでも作用できるため、多様なトランスポゾン構造が可能になります。トランスポゾン自体は逆方向反復配列に挟まれており、それぞれが直接的に2回繰り返され、IR/DR配列と呼ばれます。内部領域は転移される遺伝子または配列で構成され、トランスポザーゼ遺伝子も含まれる場合があります。あるいは、トランスポザーゼは別のプラスミドにコードするか、タンパク質の形で注入することもできます。さらに別の方法として、トランスポゾンとトランスポザーゼの両方の遺伝子をウイルスベクターに組み込み、目的の細胞または組織を標的とする方法もあります。トランスポザーゼタンパク質は結合する配列に対して非常に特異的であり、3塩基対の違いでIR/DR配列を類似配列から識別することができます。酵素がトランスポゾンの両端に結合すると、IR/DR配列がシナプス複合体形成（SCF）でトランスポザーゼによって結合され、保持されます。SCFの形成は、適切な切断を保証するチェックポイントです。HMGB1は、真核生物のクロマチンに関連する宿主由来の非ヒストンタンパク質です。HMGB1は、トランスポザーゼのIR/DR配列への優先的な結合を促進し、SCF複合体の形成/安定性に不可欠であると考えられます。トランスポザーゼは標的部位でDNAを切断し、3'突出部を生成します。次に、酵素は宿主ゲノム中のTAジヌクレオチドを標的部位として組み込みます。DNAを切断したのと同じ酵素触媒部位が、DNAをゲノムに組み込み、その過程でゲノム領域を複製します。トランスポザーゼはTAジヌクレオチドに特異的ですが、ゲノム中のこれらのペアの頻度が高いことから、トランスポゾンはかなりランダムに組み込まれることがわかります。^{[ 8 ]}

1999年、マイコバクテリウム結核菌に関連する病原性遺伝子は、トランスポゾン変異誘発による遺伝子ノックアウトによって同定された。カナマイシン耐性遺伝子とIS 1096挿入配列を含むpCG113というプラスミドは、可変80塩基対タグを含むように設計された。次に、このプラスミドはエレクトロポレーションによってM.結核菌細胞に形質転換された。コロニーはカナマイシン培地に播種され、耐性細胞が選択された。ランダム転移イベントを受けたコロニーは、Bam HI消化と内部IS 1096 DNAプローブを用いたサザンブロッティングによって同定された。コロニーは、増殖能の低下についてスクリーニングされ、候補病原性遺伝子に変異を持つコロニーが同定された。増殖能の低下を引き起こす変異は、 IS 1096配列に隣接する領域を増幅することによってマッピングされ、公開されているM.結核菌ゲノムと比較された。この事例では、トランスポゾン変異誘発により、これまで疾患と関連付けられていなかった結核菌ゲノム内の13の病原性遺伝子座が特定されました。 ^{[ 10 ]}これは、細菌の感染サイクルを理解する上で不可欠な情報です。

モンシロチョウ（ Trichoplusia ni）由来のPiggyBac （PB）トランスポゾンは、哺乳類細胞で高い活性を示すように改変され、ゲノム全体にわたる突然変異誘発が可能となった。トランスポゾンは、PBとSleeping Beautyの両方の逆方向反復配列を含み、両方のトランスポザーゼに認識され、転移頻度を高めるように設計されている。さらに、トランスポゾンにはプロモーターとエンハンサー、スプライスドナーとアクセプターが含まれており、トランスポゾンの向きに応じて機能獲得または機能喪失の突然変異を起こせるようになっている。また、双方向ポリアデニル化シグナルも含まれている。トランスポゾンはin vitroでマウス細胞に導入され、腫瘍を含む変異体が解析された。腫瘍形成につながる突然変異のメカニズムによって、その遺伝子が癌遺伝子か腫瘍抑制遺伝子かが決定された。癌遺伝子は遺伝子の過剰発現につながる領域への挿入によって特徴づけられる傾向があるのに対し、腫瘍抑制遺伝子は機能喪失変異に基づいて分類される。マウスはヒトの生理機能や疾患の研究におけるモデル生物であるため、この研究は癌を引き起こす遺伝子や潜在的な治療標的についての理解を深めるのに役立つだろう。^{[ 9 ]}