トランスプラストミック植物

トランスプラストミック植物とは、遺伝子が不活性化、改変されたり、核 DNA の代わりに葉緑体などのプラスチドのDNAに新しい外来遺伝子が挿入された遺伝子組み換え植物です。

現在、トランスプラストミック植物の大部分は、他のプラスチドでの発現が乏しいため、葉緑体操作の結果である。^{[1]しかし、この技術は}トマトのクロモプラストに適用され、成功を収めている。^[2]

植物の葉緑体は、光合成細菌（シアノバクテリアの祖先）が真核生物に取り込まれたことで誕生したと考えられています。 ^[3]葉緑体のDNA操作は細菌起源であるため、多くの利点があります。例えば、複数の遺伝子（オペロン）を多くのステップではなく1つのステップで導入できることや、細菌の遺伝子発現システムで多くの遺伝子を同時に発現できることなどです。^{[4]その他の利点としては、}タンパク質などの有機物を高濃度で得ることができること、これらの製品の生産がエピジェネティック制御の影響を受けないことなどが挙げられます。^[5]

高濃度で生成物が合成される理由は、1つの植物細胞が最大100個の葉緑体を持つ可能性があるためです。これらすべてのプラスチドが形質転換されれば、それらすべてが導入された外来遺伝子を発現することができます。^{[1]核には通常}、遺伝子のコピーが1つまたは2つしか含まれていないため、これは核の形質転換に比べて有利である可能性があります。^[1]

葉緑体DNA操作の利点から、特に農業や製薬への応用において、この研究開発分野への関心が高まっています。^{[5]しかし、葉緑体DNA操作には、}穀物作物のDNA材料を操作できないことや、前述のように非緑色のプラスチドでは外来DNAの発現が乏しいことなど、いくつかの制限があります。 ^{[5]さらに、プラスチドでは}グリコシル化などの翻訳後修飾機能がないため、一部のヒト関連タンパク質の発現が困難になる可能性があります。^{[6]それでも、植物トランスプラストミクスでは、トランスプラストミクス}タバコ植物を使用した破傷風の食用ワクチンの製造など、大きな進歩が遂げられています。^[7]

トランスプラストミック植物生成の第一の要件は、大腸菌プラスミドベクターの形で葉緑体などのプラスチドに導入できる適切な遺伝子構築物を持つことです。^[8]適切な遺伝子カセットには、（1）選択マーカー、 （2）フランキング配列、（3）目的の遺伝子、（4）プロモーター配列、（5）5' UTR、（6）3' UTR、（7）シストロン間要素など、いくつかの重要な特徴があります。^[9]選択マーカーは通常、抗生物質耐性遺伝子である傾向があり、これにより植物細胞は抗生物質を含む寒天培地上での増殖に耐える能力を付与されます。^{[5]フランキング配列は、}相同組み換えによってプラスチドゲノムの正確に所定のポイントに遺伝子構築物を導入するために重要です。^[4]導入される目的遺伝子にはさまざまな用途があり、害虫耐性遺伝子からワクチン抗原生産まで多岐にわたります。^{[4]インターシストロンエレメント（IEE）は、複数の遺伝子が}オペロンの形で導入された場合に、高レベルの遺伝子発現を促進するために重要です。^[4]最後に、5' UTRと3' UTRはそれぞれリボソーム結合を強化し、転写産物の安定性を高めます。^[4]

プラスチドの形質転換の最も一般的な方法は、微粒子銃による方法です。金やタングステンの小さな粒子をプラスミドベクターでコーティングし、若い植物細胞や植物の胚に撃ち込み、複数の細胞層を貫通してプラスチドに浸透させます。^{[8]次に、撃たれたプラスミドベクターと}プラスチドのゲノムの間で相同組換えが起こり、遺伝子カセットがプラスチドに安定して挿入されることが期待されます。^[8]形質転換の効率は、植物遺伝子工学でも一般的なアグロバクテリア媒介形質転換よりも低いですが、粒子銃による方法は特に葉緑体の形質転換に適しています。その他の形質転換方法には、ポリエチレングリコール(PEG) 媒介形質転換の使用が含まれます。これは、植物細胞壁を除去して「裸の」植物細胞をPEG 存在下で形質転換用の外来遺伝物質にさらすものです。^[8]しかし、PEGを介した形質転換は、植物細胞の重要な保護構造成分である細胞壁の除去を必要とするため、時間がかかり、非常に技術的で労働集約的であることが知られています。^[10]興味深いことに、2018年に発表された論文では、電気穿孔法による微細藻類種N. oceanicaとC. reinhardtiiの葉緑体のプラスチド形質転換の成功について説明されています。^{[10]電気穿孔法を使用した}高等植物のプラスチド形質転換の研究はまだ試みられていませんが、これは将来的に興味深い研究分野になる可能性があります。

細胞内で持続し安定的に維持されるためには、プラスミド DNA 分子には複製起点が含まれていなければならず、これにより染色体とは独立して細胞内で複製される。外来 DNA が初めて植物組織に導入されたとき、すべての葉緑体が導入した遺伝物質をうまく統合しているわけではない。^[5]植物細胞内には、正常な葉緑体と形質転換した葉緑体が混在する。この正常な葉緑体と形質転換した葉緑体の混合は、「異質な」葉緑体集団と定義される。^[5]導入された遺伝子の安定した遺伝子発現には、植物細胞内のすべての葉緑体が外来遺伝物質をうまく統合した、形質転換した葉緑体の「同質な」集団が必​​要である。 ^[5]通常、同質性は抗生物質による複数回の選抜によって達成および識別できる。^[5]これは、形質転換した植物組織をスペクチノマイシンなどの抗生物質を含む寒天培地上で繰り返し培養する場合である。^[5]上記のように遺伝子カセットをうまく組み込んだ植物細胞だけが抗生物質耐性選択マーカーを発現することができ、抗生物質を含む寒天培地上で正常に生育します。^[5]正常に生育しない植物組織は、スペクチノマイシン抗生物質が植物細胞のプラスチドのリボソームを阻害し、葉緑体の維持を妨げるため、白く​​変色した外観になります。 ^[5]しかし、異質な葉緑体集団は寒天培地上で効果的に生育できる可能性があるため、同質で安定した植物組織を培養するには、抗生物質による選択と再生を何度も繰り返す必要があります。^[5]同質植物組織の生成は、トランスプラストミクスにおける大きな困難であり、非常に時間がかかると考えられています。^[8]

ニコチアナ・タバカムなどの一部の植物種は、ニコチアナ・グラウカやニコチアナ・ベンサミアナなどの同じ属のメンバーと比較して、トランスプラストミクスに対する受容性が高い。^[11] 2012年に実施された実験では、接ぎ木を使用することで難しい植物種のトランスプラストミクスを容易にする可能性が強調された。接ぎ木は、2つの異なる植物を接合して成長させることで発生し、この技術は農業用途で広く使用されており、野生でも自然に発生する可能性がある。^[12]トランスプラストミクスN. tabacum植物は、スペクチノマイシン耐性とGFP蛍光を持つように操作された。 [ ^11]一方、核トランスジェニック植物N. benthamianaとN. glaucaは、カナマイシン抗生物質耐性とYFP蛍光を持つように操作された。^[11]次に、トランスプラストミクス植物と核トランスジェニック植物を互いに接ぎ木し、接ぎ木した組織を分析した。^[11] 蛍光顕微鏡検査とカナマイシンとスペクチノマイシンの両方を含む寒天培地での抗生物質選択により、接ぎ木された植物組織にはトランスプラストミックと核トランスジーンDNA物質の両方が含まれていることが明らかになりました。^{[ 11]これは}PCR分析によってさらに確認されました。[11]この研究は、葉緑体のようなプラスチドが接ぎ木接合部を越えて細胞間を移動し、2つの異なる植物細胞株間で遺伝物質の移動を引き起こすことを明らかにしました。 ^[11]この発見は、上記のように現在の実験方法論では簡単に形質転換できない種に対して、トランスプラストミック植物を生成するための代替経路を提供するため重要です。^[11]

オリボスイッチやペンタトリコペプチドリピートタンパク質などの誘導発現システムは、トランスプラストミック植物におけるトランスジーン産物の発現を制御および調節する目的で広く研究されてきた。^[13]誘導発現システムを使用する大きな利点の 1 つは、トランスジーンタンパク質の生産濃度を最適化できることである。^[13]たとえば、若い植物は、成熟した植物になるために、成長と発達にエネルギーとリソースを費やす必要がある。^{[13] したがって、トランスジーンの}恒常的発現は、貴重なエネルギーとリソースを奪って代わりに外来遺伝子構造を発現させるため、植物の成長と発達に有害である。 [13]その結果、トランスプラストミック植物は十分に発達せず、産物収量も低くなる。^[13]トランスジーンの誘導発現はこの制限を克服し、化学的に誘導されてトランスジーンの生成を開始し、収穫できるようになる前に、植物を通常の野生型植物のように完全に成熟させることができる。 ^[13]

遺伝子組み換え植物は、環境に対して安全で、従来の作物や有機栽培作物との共存に適していなければなりません。従来の核遺伝子組み換え作物にとっての大きな障害は、花粉の移動による遺伝子組み換えの潜在的な異系交配です。当初は、花粉に遺伝子組み換えを含まないトランスプラストミック植物を生み出すプラスチド変換は、生物学的安全性を高めるだけでなく、遺伝子組み換え、従来の農業、有機農業の共存を促進すると考えられていました。したがって、そのような作物の開発は、Co-ExtraやTranscontainerなどの研究プロジェクトの主要な目標でした。

しかし、2007年にタバコ植物を対象に行われた研究により、この理論は否定されました。ドイツのマックスプランク分子植物生理学研究所のラルフ・ボック氏が率いる研究者らは、トランスジーンが葉緑体に組み込まれた遺伝子組み換えタバコを研究しました。^[14] 葉緑体を介した形質転換によって生成されたトランスプラストミックタバコ植物は、葉緑体がそのままの雄性不稔の植物と交配されました。^[14]トランスプラストミック植物は、抗生物質スペクチノマイシンに耐性を持つように操作され、緑色蛍光タンパク質分子（GFP）を生成するように操作されました。^[14]したがって、葉緑体の遺伝物質は花粉を介して伝達できないため、これらの2つのタバコ植物の系統から生成された子孫はスペクチノマイシン上で成長したり蛍光を発したりすることはできないという仮説が立てられました。^[14]しかし、いくつかの種子は抗生物質に耐性があり、スペクチノマイシン寒天培地で発芽できることがわかりました。^{[14]計算によると、100万個の}花粉のうち1個にプラスチド遺伝物質が含まれていることが示されており、これは農業環境では重要な意味を持つ。^[14]タバコは自家受粉の傾向が強いため、トランスプラストミック植物の信頼性は圃場ではさらに高いと想定される。したがって、研究者らは、1億個の遺伝子組み換えタバコ植物のうち1個だけが実際に花粉を介してトランス遺伝子を伝達すると考えている。このような値は共存を保証するには十分すぎるほどである。しかし、医薬品の製造に使用される遺伝子組み換え作物や、交配が絶対に許可されないその他のケースでは、研究者らは葉緑体形質転換と細胞質雄性不稔やトランス遺伝子緩和戦略などの他の生物学的封じ込め方法を組み合わせることを推奨している。この研究は、トランスプラストミック植物は絶対的な遺伝子封じ込めを持たないものの、封じ込めレベルは非常に高く、従来の農作物と遺伝子組み換え作物の共存を可能にすることを示した。^[14]

抗生物質耐性遺伝子が細菌や雑草などの望ましくない標的に伝達される可能性について、国民の間で懸念が広がっている。^[15]この結果、選択可能な抗生物質耐性遺伝子マーカーを除去する技術が開発されてきた。実装されているそのような技術の1つがCre/loxシステムであり、核コード化されたCreリコンビナーゼを誘導プロモーターの制御下に置くことで、形質転換プロセスによってホモプラスミック性が達成された後に抗生物質耐性遺伝子を除去することができる。^[16]

農業への応用におけるトランスプラストミクスの最近の例としては、ジャガイモ植物をコロラドハムシから守るというものがあります。^{[17]このハムシは多くの}殺虫剤に対する耐性を獲得し、非常に貪欲に餌を食べることから、国際的に「スーパー害虫」と呼ばれています。 [17]このハムシはミシガン州だけで年間最大140万ドルの農作物被害を引き起こしていると推定されています。^[18] 2015年に張氏が実施した研究では、トランスプラストミクスを利用して、トランス遺伝子を生成する二本鎖RNAをプラスチドゲノムに導入しました。^{[17]二本鎖RNAは}RNA干渉法によってトランスジェニックジャガイモ植物に保護を付与します。この方法では、ハムシが植物組織を消費すると、ハムシが生存するために必要な主要な遺伝子がサイレンシングされます。 ^[17]高いレベルの保護が与えられ、トランスプラストミックジャガイモの葉は成虫や幼虫にさらされてもほとんど消費されませんでした。^[17]調査では、トランスプラストミック植物の葉を食べた幼虫の殺虫効果が83％であることも明らかになりました。 ^[17]この研究は、害虫が従来の化学殺虫剤に対する耐性を獲得するにつれて、RNAIを介した作物保護戦略を実施するためのトランスプラストミックの使用が将来ますます実現可能になる可能性があることを強調しています。^[17]

もう一つの注目すべきトランスプラストミクスに基づくアプローチは、トランスプラストミクスタバコ植物を介したアルテミシニン酸の生産であり、これはアルテミシニンの生産に使用できる前駆分子である。^[19] アルテミシニンに基づく併用療法は、 WHO（世界保健機関）がマラリアに対する選択肢として推奨する治療法である。^{[19]アルテミシニンは、} Artemisia annuaという植物から自然に抽出されるが、この植物では低濃度のアルテミシニンしか自然に収穫できず、現在、世界的な需要に対して供給が不十分である。^[19] 2016年にフエンテスが率いて実施した研究では、バイオリスティックス手法によりN. tabacumの葉緑体にアルテミシニン酸生産経路を導入し、その後、新しい合成生物学ツールCOSTREL（トランスプラストミクス受容体株の組み合わせによる超形質転換）を使用して、アルテミシニン酸の収量が極めて高いトランスプラストミクスN. tabacum植物を生成しました。 ^[20]この研究は、将来の バイオ医薬品への応用におけるトランスプラストミクスの潜在的な利点を示しています。

トランスプラストミクスは現時点では非緑色プラスチドでは実行不可能であるが、葉緑体ゲノムに対して行われた植物トランスプラストミクス研究は非常に価値があることが証明されている。^[4]葉緑体形質転換の用途は、農業、バイオ燃料、バイオ医薬品などを含むが、これらに限定されない。 [4]これは、オペロンの形での複数のトランスジーン発現の容易さや高コピー数発現など、いくつかの要因による。^[4]トランスプラストミクスの研究はまだ進行中である。非緑色プラスチドでのトランスプラストミクス、トランスプラストミクスによる穀物作物の形質転換の不可能性、葉緑体でのグリコシル化能力の欠如を回避する方法など、他の領域を改善するには、さらなる研究開発が必要である。 ^[4]この研究分野がさらに改善されれば、私たちの日常生活で重要な多くの用途において、潜在的に強力なバイオテクノロジーのルートが得られることになるだろう。

• Co-Extra 2016-10-06にWayback Machineでアーカイブ遺伝子組み換え植物の共存とトレーサビリティに関する研究
• トランスコンテナ 遺伝子組み換え植物の生物学的封じ込めシステムの開発