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制限点（R ）は、スタートまたはG 1 /Sチェックポイントとも呼ばれ、動物細胞周期のG 1期にある細胞周期チェックポイントであり、細胞が細胞周期に「コミット」され、その後は細胞外シグナルが増殖を刺激する必要がなくなります。[ 1 ]制限点の決定的な生化学的特徴は、G 1 /S期およびS期のサイクリン-CDK複合体の活性化であり、これがDNA複製、中心体複製、およびその他の初期細胞周期イベントを開始するタンパク質をリン酸化します。 [ 2 ]これは、3つの主要な細胞周期チェックポイントの1つであり、他の2つはG2-M DNA損傷チェックポイントと紡錘体チェックポイントです。
元々、ハワード・マーティン・テミンは、ニワトリ細胞がDNA複製に専念する段階に達し、細胞外シグナルに依存しなくなることを示した。[ 3 ]約20年後の1973年、アーサー・パーディーは、 G1期に単一の制限点が存在することを実証した。それまで、G1期は単に有糸分裂とS期の間の時間として定義されていた。G1期における細胞の位置を示す分子マーカーや形態マーカーは知られていなかった。パーディーは、細胞をある細胞周期ブロック（重要なアミノ酸除去や血清除去など）から別のブロックに移行させ、各ブロックのS期への進行阻止効率を比較する二重ブロック法を用いた。彼は、調べたすべてのケースで両方のブロックがS期への進行を阻止するのに同等の効率であることを発見し、それらはすべてG1期の同じ点に作用しているに違いないことを示しており、彼はそれを「制限点」またはR点と名付けた。[ 4 ]
1985年、ゼッターバーグとラーソンは、細胞周期のすべての段階で血清欠乏がタンパク質合成の阻害をもたらすことを発見した。分裂後細胞（すなわちG1期初期の細胞）においてのみ、血清除去によって細胞は静止期（G0期）に移行した。実際、ゼッターバーグは、細胞周期の長さの変動のほぼすべてが、細胞が制限点からS期に移行するのにかかる時間によって説明できることを発見した。[ 5 ]
初期胚発生を除いて、多細胞生物のほとんどの細胞は、増殖が起こらず、通常は終末分化したG0と呼ばれる静止状態にあります。一方、他の特殊化した細胞は、成体になるまで分裂を続けます。これらの細胞群のどちらについても、細胞周期から離脱して静止状態（G0）になるか、G1に再突入するかの決定がなされています。
細胞が細胞周期に入るか、または再び入るかの決定は、G 1 期の S 期に入る前に制限点と呼ばれる場所で行われ、受け取られ処理される促進的および抑制的な細胞外シグナルの組み合わせによって決定されます。R 点より前では、細胞は G 1期の最初の 3 つのサブフェーズ (コンピテンス、G 1a 期への進入、G 1b 期の進行) を進むためにこれらの細胞外刺激を必要とします。しかし、G 1b期で R 点を通過すると、細胞外シグナルはもはや必要なくなり、細胞はDNA 複製の準備に不可逆的にコミットします。それ以降の進行は細胞内メカニズムによって制御されます。細胞が R 点に到達する前に刺激を除去すると、細胞が静止状態に戻る可能性があります。[ 1 ] [ 3 ]このような状況では、細胞は実際に細胞周期で後退し、制限点を通過した後、S 期に入るために追加の時間 (培養からの除去時間より約 8 時間長い) を必要とします。[ 3 ]
成長因子（PDGF、FGF、EGFなど）は、細胞の細胞周期への進入と制限点への進行を調節します。このスイッチのような「後戻りできない点」を通過すると、細胞周期の完了はもはや分裂促進因子の存在に依存しなくなります。[ 6 ] [ 4 ] [ 7 ] 持続的な分裂促進因子シグナル伝達は、主にG1サイクリン（サイクリンD1-3）とそのCdk4/6との結合の調節を介して細胞周期への進入を促進し、これはMAPK経路とPI3K経路の両方を介して並行して媒介される可能性があります。
細胞外増殖因子が受容体チロシンキナーゼ（RTK）に結合すると、構造変化が引き起こされ、RTKの細胞質尾部にあるチロシン残基の二量体化と自己リン酸化が促進される。これらのリン酸化されたチロシン残基は、SH2ドメインを含むタンパク質（例：Grb2）のドッキングを促進し、その後、他のシグナル伝達タンパク質を細胞膜にリクルートしてシグナル伝達キナーゼカスケードを活性化する。RTKに結合したGrb2は、膜結合型Rasを活性型（Ras-GDP）に変換するグアニンヌクレオチド交換因子であるSosに結合する。Ras-GTP）。[ 8 ]活性RasはMAPキナーゼカスケードを活性化し、Rafに結合して活性化し、RafはMEKをリン酸化して活性化し、MEKはERK（MAPKとも呼ばれる、MAPK/ERK経路も参照）をリン酸化して活性化する。
活性型ERKは核に移行し、転写因子血清応答因子（SRF）などの複数の標的を活性化し、即時初期遺伝子、特に転写因子FosとMycの発現を引き起こします。[ 8 ] [ 9 ] Fos/Jun二量体は転写因子複合体AP-1を構成し、主要なG1サイクリンであるサイクリンD1を含む遅延応答遺伝子を活性化します。[ 8 ] Mycはまた、サイクリンD2とCdk4の誘導を含む、さまざまな増殖促進遺伝子と成長促進遺伝子の発現を調節します。[ 5 ]さらに、持続的なERK活性はCDK2のリン酸化と核局在化に重要であると考えられており、[ 8 ]制限点を通過する進行をさらに裏付けています。
別のSH2ドメイン含有タンパク質であるp85は、活性化RTKに結合し、PI3K（ホスホイノシチド-3-キナーゼ）をリクルートして、リン脂質PIP2をPIP3にリン酸化し、Akt（PHドメインを介して）をリクルートします。Aktは、他の成長促進機能や生存促進機能に加えて、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β（GSK3β ）を阻害し、GSK3βを介したサイクリンD1のリン酸化とその後の分解を防ぎます[ 10 ]（図[ 11 ]を参照）。 Akt は、mTOR を介したサイクリン D1 翻訳の促進、[ 12 ] Cdk 阻害因子p27 Kip1 (核内移行を阻害) およびp21 Cip1 (安定性を低下) のリン酸化、および転写因子FOXO4 (p27 発現を調節) の不活性化リン酸化によって、G1/S 成分をさらに調節します。[ 13 ]このサイクリン D1 の安定化と Cdk 阻害因子の不安定化が相まって、G1 および G1/S-Cdk 活性が促進されます。
サイトカインTGF-βのような抗分裂因子は制限点を通過する進行を阻害し、G1期停止を引き起こします。TGF-βシグナル伝達はSmadを活性化し、SmadはE2F4 /5と複合体を形成してMycの発現を抑制し、またMiz1と結合してCdk阻害因子p15 INK4bの発現を活性化し、サイクリンD-Cdk複合体の形成と活性を阻害します。[ 8 ] [ 14 ] TGF-βで停止した細胞ではp21とp27も蓄積します。[ 14 ]
前述のように、細胞外成長因子からのシグナルは典型的な方法で伝達されます。成長因子は細胞表面の受容体に結合し、さまざまなリン酸化カスケードによってCa2 +の取り込みとタンパク質のリン酸化が起こります。リン酸化タンパク質のレベルはホスファターゼによってバランスが取られます。最終的に、特定の標的遺伝子の転写活性化が起こります。細胞外シグナル伝達は維持されなければならず、細胞は迅速なタンパク質合成を支えるのに十分な栄養素も利用できる必要があります。サイクリンDの蓄積は不可欠です。[ 15 ]
サイクリン D に結合したCdk 4と6はCdk 活性化キナーゼによって活性化され、細胞を制限点へと導きます。しかし、サイクリン D はターンオーバー率が高い (t 1/2 <25 分)。このターンオーバー率が速いため、細胞は有糸分裂促進シグナルレベルに非常に敏感であり、有糸分裂促進シグナルレベルはサイクリン D の産生を刺激するだけでなく、細胞内でのサイクリン D の安定化にも役立ちます。[ 15 ] [ 16 ]このように、サイクリン D は有糸分裂促進シグナルセンサーとして機能します。[ 16 ] Ink4タンパク質やp21などのCdk 阻害剤(CKI) は、不適切なサイクリン-cdk 活性を防ぐのに役立ちます。
活性型サイクリンH-cdk複合体は核内で網膜芽細胞腫タンパク質（pRb）をリン酸化する。リン酸化されていないRbは、 E2Fを介した転写を阻害することでG1期の阻害因子として機能する。リン酸化されたE2Fは、サイクリンEとAの転写を活性化する。[ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]図に示すように、活性型サイクリンE-cdkが蓄積し始め、pRbのリン酸化を完了する。[ 18 ]
p27とp21は、G1/S-およびS-サイクリン-Cdk複合体の化学量論的阻害因子である。細胞周期への進入中にp21レベルは増加するが、細胞が後期G1期に進むにつれてp27は一般的に不活性化される。[ 8 ] 細胞密度が高い場合、マイトジェン飢餓、およびTGF-βはp27の蓄積と細胞周期停止を引き起こす。[ 14 ]同様に、DNA損傷やその他のストレス因子はp21レベルを増加させるが、マイトジェン刺激によるERK2およびAkt活性はp21の不活性化リン酸化につながる。[ 19 ]
p27の過剰発現に関する初期の研究では、p27が試験管内および特定の細胞種において、サイクリンD-Cdk4/6複合体およびサイクリンE/A-Cdk2複合体と結合してこれらを阻害できることが示唆された。[ 14 ]しかし、LaBaerら（1997）による速度論的研究では、p21とp27を滴定するとサイクリンD-Cdk複合体の集合が促進され、複合体の全体的な活性と核局在が増加することが明らかになった。[ 20 ]その後の研究では、p27がサイクリンD-Cdk複合体の形成に必要である可能性があり、p27 -/-、p21 -/- MEFではサイクリンD-Cdk4複合体形成の減少が見られ、p27の再発現によって回復できることが示された。[ 21 ]
James ら (2008) の研究は、p27 のチロシン残基のリン酸化が、サイクリン D-Cdk4/6 に結合している間、p27 を阻害状態と非阻害状態の間で切り替えることができることをさらに示唆しており、p27 がサイクリン-Cdk 複合体の組み立てと活性の両方を制御できる仕組みのモデルを提供しています。[ 22 ] p27 とサイクリン D-Cdk4/6 の結合は、サイクリン E-Cdk2 複合体を不活性化するために利用できる p27 のプールを制限することによって、細胞周期の進行をさらに促進する可能性があります。[ 8 ] [ 23 ] 後期 G1 におけるサイクリン E-Cdk2 活性の増加 (および初期 S におけるサイクリン A-Cdk2) は、p21/p27 のリン酸化につながり、核外輸送、ユビキチン化、および分解を促進します。
2008年にデューク大学のLingchong YouとJoe Nevinsの研究グループが発表した論文では、二安定ヒステリックE2Fスイッチが制限点の根底にあることが実証されました。E2Fは自身の活性化を促進するとともに、自身の阻害因子（pRb）の阻害も促進し、二安定システムを確立する上で重要な2つのフィードバックループ（その他にも）を形成します。この研究の著者らは、E2Fプロモーターの制御下にある不安定化GFPシステムをE2F活性の読み出しとして使用しました。血清飢餓状態の細胞を様々な血清濃度で刺激し、GFPの読み出しを単一細胞レベルで記録しました。その結果、GFPレポーターはオンかオフのどちらかであり、分析したすべての異なる血清濃度においてE2Fが完全に活性化されているか不活性化されているかを示していることがわかりました。さらに、E2Fシステムの履歴依存性を分析する実験により、E2Fがヒステリック二安定スイッチとして機能していることが確認されました。[ 24 ]
がんは、細胞が継続的に不適切に細胞周期に再突入し、 G0期に入らないため、正常な制限点機能が阻害された状態と見なすことができます。[ 1 ]制限点に至る経路の多くの段階での突然変異は、細胞のがん性増殖を引き起こす可能性があります。がんで最も一般的に変異する遺伝子には、CdkとCKIが含まれます。Cdkの過剰活性化またはCKIの低活性は制限点の厳密性を低下させ、より多くの細胞が老化を回避できるようにします。[ 17 ]
制限点は、新しい薬物療法の開発において重要な考慮事項です。正常な生理条件下では、すべての細胞増殖は制限点によって制御されています。これは、非癌細胞を化学療法から保護する方法として利用できます。化学療法薬は通常、急速に増殖している細胞を攻撃します。成長因子受容体阻害剤などの制限点の完了を阻害する薬剤を使用することで、正常細胞の増殖が阻止され、化学療法から保護されます。[ 16 ]
{{cite book}}: CS1 maint: 複数名: 著者リスト (リンク) CS1 maint: 数値名: 著者リスト (リンク)