G2-M DNA損傷チェックポイント

G ₂ -M DNA 損傷チェックポイントは、真核生物における重要な細胞周期チェックポイントであり、損傷した DNA または複製が不完全な DNA が十分に修復されるまで細胞が有糸分裂を開始しないようにします。G ₂ -M チェックポイントに欠陥のある細胞は、DNA を修復する前に M 期に入ると、細胞分裂後にアポトーシスまたは死に至ります。 ^{[1]このチェックポイントの特徴的な生化学的特徴は、} M 期サイクリン-CDK 複合体の活性化であり、これが紡錘体の組み立てを促進して細胞を中期に導くタンパク質をリン酸化します。^[2]

細胞周期は、細胞周期のさまざまなチェックポイントでサイクリン調節タンパク質と関連するサイクリン依存性キナーゼと呼ばれるタンパク質によって駆動されます。細胞周期のさまざまな段階で、特定のサイクリン-CDK 複合体の活性化および/または不活性化が起こります。

サイクリンB-CDK1 活性は G2/M チェックポイントに特異的です。サイクリン Bの蓄積により、細胞が有糸分裂に入る準備が整うにつれて、サイクリン依存性キナーゼ Cdk1 ヒト相同体Cdc2の活性が高まります。Cdc2活性は、対応する活性化因子と阻害因子のリン酸化/脱リン酸化によってさらに制御されます。正のフィードバックループを通じて、サイクリンB-Cdc2 はホスファターゼCdc25 を活性化し、次にサイクリンB-Cdc2 阻害因子であるWee1と Myt1 を不活性化します。Cdc25 は活性部位からリン酸を除去することで複合体を活性化し、Wee1 はチロシン残基、特にチロシン 15 のリン酸化によって複合体を不活性化します。^[3]

このループは、オーロラAキナーゼとボラ補因子の協調的な相互作用によって間接的にさらに増幅されます。G2期には、ボラが蓄積してオーロラAと活性化複合体を形成します。この複合体は次にポロ様キナーゼ1（Plk1）の活性化を制御します。Plk1はWee1をリン酸化してSCFユビキチンリガーゼ複合体（SCF複合体）を介して分解を標的とし、リン酸化を介してCdc25を活性化し、Cdc2を活性化する複合作用を持ちます。Cdc2、Cdc25、およびPlk1の複合活性と複合体はサイクリンBの蓄積と相まってサイクリンB-Cdc2複合体を活性化し、有糸分裂への移行を促進します。^[4]

この正のフィードバックループに関与する多くのタンパク質は、有糸分裂に入るには全か無かの応答が必要であるため、サイクリンB-Cdc2複合体の活性化を促進する。ノヴァック-タイソンモデルは、ヒステリシスによって引き起こされる有糸分裂への不可逆的な移行を予測したこのような制御ループを説明するために使用される数学モデルである。^[5]アフリカツメガエルの無細胞卵抽出物 での実験を通じて、このモデルは有糸分裂に入るための基礎であることが確認された。サイクリン濃度が特定の最小活性化閾値に達すると、Cdc2は急速に活性化される。活動が別の不活性化閾値を下回るまで、Cdc2はこの状態を維持し、その下でWee1とMyt1によるチロシンリン酸化によって突然不活性化される。複製されていないDNAの場合、Cdc2活性化のサイクリン濃度閾値はさらに増加する。このメカニズムにより、不安定な定常状態によって区切られた2つの別個の定常状態条件が存在します。サイクリンB-Cdc2の双安定性とヒステリシス特性は、G2/Mチェックポイントの高度に制御された性質を保証する。^[6]

G2 期の DNA 損傷部位に局在するタンパク質は、上記のように、経路の重要な構成要素を制御するシグナル伝達カスケードを開始し、サイクリン B-Cdc2 活性を介して有糸分裂の開始を制御します。サイクリン B-Cdc2 活性の負の制御は有糸分裂の開始を遅らせます。これは、 S 期後に蓄積された可能性のある DNA 損傷を細胞が修復するために重要であり、細胞分裂を継続する前に必要です。

G2-M チェックポイントで機能するタンパク質は、もともと、放射線に対する感受性が高まった変異体 (「rad」変異体と呼ばれる) を探す酵母スクリーニングで特定されました。^[1]これらの変異体では、電離放射線や化学物質によって損傷した DNA の修復が不十分であったため、この経路に不可欠なタンパク質が明らかになりました。チェックポイント経路の初期シグナル伝達タンパク質は、ホスファチジルイノシトール 3 キナーゼ ファミリーのメンバーで、酵母では rad3、脊椎動物ではATR であり、DNA 損傷部位に局在すると考えられています。^[7] Rad3 は、チェックポイントの開始に必要な rad26 をリン酸化しますが、チェックポイントの維持には不要です。Rad3 は、rad1、rad9、hus1、rad17 など、存在しないとチェックポイント DNA 修復が無効になる他の多くのタンパク質もリン酸化します。^{[1] rad9、hus1、rad17は、} DNA複製中にDNAポリメラーゼのプロセッシビティを高めるクランプの形成に関与するタンパク質に類似しているという仮説が立てられている。^{[8]この考えと一致して、rad17はDNAにクランプをロードするタンパク質に類似している。これは、rad3によるリン酸化によってこれらのタンパク質がDNA損傷部位にリクルートされ、} DNA修復に関与するDNAポリメラーゼの活性を媒介するというモデルを支持する。^[1]

rad3 の主なエフェクターはキナーゼChk1であり、これは DNA 損傷因子に反応して G2-M 停止に必要である。^[9] Chk1 は有糸分裂サイクリンを不活性状態に維持するエフェクタータンパク質キナーゼであり、S 期と有糸分裂の間に rad3 によってリン酸化されるため、G2 停止における特定の役割が示唆されている。^[10]過剰発現による そのアップレギュレーションは、 DNA 損傷とは無関係に停止を誘導することができる。^[11] さらに、Chk1 の過剰発現は、おそらく有糸分裂に入る前に DNA 修復が行われるようにすることで、rad 変異体の放射線感受性を回復させる。^[7]

DNA損傷の存在は、それぞれChk2およびChk1キナーゼを活性化するATM（毛細血管拡張性運動失調症変異）またはATR（毛細血管拡張性運動失調症およびRad3関連）経路を誘発する。これらのキナーゼは、サイクリンB-Cdc2複合体の直接制御因子であるCdc25およびWee1の上流で作用する。Chk1およびChk2はCdc25をリン酸化してそのリン酸化活性を阻害し、ユビキチン化分解のために標識する。^{[11] [12]} これらの経路は腫瘍抑制因子p53も刺激する。p53は、それぞれCdk2阻害剤p21および14-3-3タンパク質の機能を制御し、14-3-3タンパク質はCdc25をリン酸化（したがって不活性化）し、細胞質に隔離する。^[13] 最近の研究では、Cdk1および14-3-3が同様にWee1を正に制御することも示唆されている。 Cdk1によるWee1の過剰リン酸化により14-3-3が結合し、Wee1が核内に隔離され、Cdc2をリン酸化できる能力が強化される。^[14] Wee1とCdc25の両方のリン酸化はCdc2の活性化を防ぐ。^[12]

ATM/ATR経路はPlk1の負の制御にもつながり、Wee1の安定性に寄与する。Wee1とMyt1の安定化により細胞はG2期で停止し、DNA修復が可能になる。^{[13] [15]}

チェックポイント応答には複数の経路が関与しているため、一部のモデルが提唱しているように、Cdc25 の標的化は細胞周期遅延の唯一のメカニズムではありません。複製されていない DNA または損傷した DNA に反応して、Wee1 の正の制御と Chk1 による Cdc25 の負の制御が協同的に行われると、強力な G2 停止が発生します。^{[1] [11] [13] [15]} Wee1 の量の増加と Cdc25 の量の減少は、細胞を有糸分裂に導くために必要なヒステリシス ループ内のサイクリン B 濃度閾値の増加に寄与します。

Rad3はChk1の活性化とG2停止の開始に必要ですが、十分なDNA修復が起こるようにG2停止を維持するのは別のタンパク質だと考えられています。そのようなタンパク質の1つがrad18で、Chk1がリン酸化されて活性化しているときでもG2停止に必要です。つまり、rad18はG2/Mチェックポイントの維持に必要であり、Chk1はチェックポイントの開始に必要です。^[16]これは、DNA修復、特に染色体構造の維持における追加機能によってさらに裏付けられています。rad18がなければ、他の手段でG2停止が延長されてもDNAを修復できないという事実によって、その必要性が実証されています。

G2期でのこのような停止の維持は、p53とp21によってさらに持続されます。p53またはp21がない場合、放射線を浴びた細胞は有糸分裂に進むことが実証されています。^[17] p21または14-3-3がない場合、サイクリンB-Cdc2複合体を十分に阻害することができず、DNA損傷に対するG2チェックポイントでのp53とp21の調節制御が示されます。^[12] p53の変異は重大なチェックポイントの欠陥を引き起こす可能性があり、これは癌の治療に重要な意味を持ちます。

Wee1とCdc25の両方を不活性化すると、G2-M DNA損傷チェックポイントが廃止されます。Wee1が欠如しているか、チロシン15部位が除去されると、Cdc2活性の負の調節がなくなり、細胞は修復を完了せずに有糸分裂に入り、G2-Mチェックポイントが事実上廃止されます。^[18] Cdc25が欠如すると、細胞はG2で停止しますが、G2-Mチェックポイントは活性化されるため、Wee1の活性化とCdc25の不活性化の両方がチェックポイントの重要な調節ステップであることが示唆されます。^[11]

Chk1の不活性化は、DNA損傷が修復されるかどうかに関係なく、チェックポイントを通過して有糸分裂への移行を促進するのに十分です。しかし、チェックポイントの終了に関する正確なメカニズムについてはまだほとんどわかっていませんが、可能性のあるメカニズムとしては、活性化リン酸化を逆転させるタンパク質ホスファターゼ、活性化タンパク質の標的ユビキチン分解、独立した経路を介して有糸分裂を促進するチェックポイント拮抗薬などがあります。^[10]

Cdk、サイクリン、p53 などの多くの細胞周期調節因子は、癌において異常な発現を示すことがわかっています。より具体的には、中心体に局在することで G2/M 遷移に関与していることが示唆されており、そのため、放射線や化学療法に対する癌の感受性を改善するために、このようなタンパク質を操作する研究が行われています。^[13] Chk1 は、DNA 損傷に反応して機能するため、癌に対する薬物標的化において重要な意味を持っています。化学療法の細胞毒性効果は、現在、チェックポイントの廃止またはチェックポイントの停止の両方に関して、G2/M 遷移の調整において研究されています。^[19] 多くの治療法は、過剰な DNA 損傷を受けた細胞を有糸分裂に進ませ、細胞死を誘導するために、チェックポイントを不活性化することに重点を置いています。^[12]