免疫組織化学

組織の固定は、組織を保存し、細胞形態を維持するために重要です。固定液の組成、固定液と組織の比率、固定液に浸漬する時間は、結果に影響します。固定液（固定剤）は、多くの場合、10% 中性緩衝ホルマリンです。通常の固定時間は、室温で 24 時間です。固定液と組織の比率は 1:1 から 1:20 の範囲です。組織が固定された後、パラフィンワックスに包埋することができます。^{[ 5 ] [ 6 ]}

凍結切片の場合、新しい抗体をテストしない限り、通常は切片作成後に固定が行われます。その場合、アセトンまたはホルマリンを使用できます。^{[ 6 ]}

組織サンプルの切片作製はミクロトームを用いて行います。パラフィン包埋組織の場合、通常の厚さは 4 μm で、凍結切片の場合は 4 ～ 6 μm です。^{[ 6 ]}切片の厚さは重要であり、免疫組織化学において重要な要素です。4 μm の厚さの脳組織の切片と 7 μm の厚さの切片を比較すると、7 μm の厚さの切片で見られるものの一部が 4 μm の切片では見られない場合があります。これは、この方法論に関連する詳細な方法の重要性を示しています。^{[ 7 ]}パラフィン包埋組織は、キシレンまたは適切な代替品で組織サンプル上および周囲のパラフィンをすべて除去するために脱パラフィン処理を行い、その後アルコールで処理する必要があります。^{[ 8 ]}

ほとんどのホルマリン固定組織切片では、免疫組織化学染色でエピトープにアクセスできるようにするには抗原賦活化が必要です。エピトープは、標的抗原を可視化するために使用される抗体の結合部位であり、固定によってマスクされている可能性があります。組織の固定により、メチレン架橋またはアミノ基の架橋が形成され、エピトープが利用できなくなる場合があります。抗原賦活化は、固定によって生じた架橋を分解することによって、マスクされた抗原性を回復させることができます。^{[ 9 ]}抗原賦活化を行う最も一般的な方法は、スライドを緩衝液に浸しながら高温加熱することです。^{[ 10 ]}これは、電子レンジ、オートクレーブ、加熱プレート、またはウォーターバスなど、さまざまな方法で行うことができます。凍結切片の場合、抗原賦活化は一般的に必要ありませんが、アセトンまたはホルマリンで固定された凍結切片の場合、抗原賦活化によって免疫組織化学シグナルを改善できます。^{[ 6 ]}

抗体の非特異的結合によりバックグラウンド染色が生じることがあります。抗体は特定の抗原決定基に結合しますが、標的タンパク質の結合部位に類似した非特異的タンパク質の部位にも部分的または弱く結合することがあります。二次抗体が産生された種から分離した正常血清で組織をインキュベートすることにより、バックグラウンド染色を低減できます。市販の汎用ブロッキングバッファーを使用することも可能です。その他の一般的なブロッキングバッファーには、正常血清、脱脂粉乳、BSA、またはゼラチンなどがあります。^{[ 5 ] [ 6 ]}内因性酵素活性もバックグラウンド染色の原因となることがありますが、組織を過酸化水素で処理すると低減できます。^{[ 5 ]}

検出に使用される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかです。ポリクローナル抗体は、モルモット、ウサギ、マウス、ラット、ヤギなどの動物を使用して作製されます。動物に目的の抗原を注射し、免疫応答を誘発します。抗体は、動物の全血清から分離できます。ポリクローナル抗体の産生により、さまざまな抗体の混合物が生成され、複数のエピトープを認識します。モノクローナル抗体は、動物に目的の抗原を注射し、その後、通常は脾臓から抗体産生B細胞を分離することによって作製されます。次に、抗体産生細胞を癌細胞株と融合させます。これにより、抗体は単一のエピトープに対する特異性を示すようになります。^{[ 12 ]}

免疫組織化学的検出戦略では、抗体は一次試薬または二次試薬に分類されます。一次抗体は目的の抗原に対して作製され、通常は非結合（非標識）です。二次抗体は一次抗体種の免疫グロブリンに対して作製されます。二次抗体は通常、ビオチンなどのリンカー分子に結合し、そのリンカー分子がレポーター分子をリクルートするか、二次抗体自体がレポーター分子に直接結合します。^{[ 11 ]}

直接法は、標識抗体が組織切片中の抗原と直接反応するワンステップ染色法です。この手法は1種類の抗体しか使用しないため、シンプルで迅速ですが、間接法とは異なり、シグナル増幅が少ないため感度が低くなります。^{[ 11 ]}

間接法では、組織内の標的抗原に結合する非標識一次抗体を使用します。次に、一次抗体に結合する二次抗体を第二層として加えます。前述のように、二次抗体は、一次抗体が作製された動物種のIgG抗体に対して作製されなければなりません。この方法は、各一次抗体に複数の二次抗体が結合することによるシグナル増幅のため、直接検出法よりも感度が高いです。^{[ 11 ]}

間接法は、感度が高いことに加えて、標準的な標識二次抗体を比較的少数しか生成する必要がないという利点もあります。例えば、ウサギIgGに対して作製された標識二次抗体は、ウサギで作製されたどの一次抗体にも使用できます。これは、研究者が複数の一次抗体を標識する場合、例えば、単一の抗原に対する一次抗体の配列をポリクローナル選択によって生成する場合や、複数の抗原に関心がある場合などに特に有用です。直接法では、関心のある抗原ごとに各一次抗体を標識する必要があります。^{[ 11 ]}

レポーター分子は検出方法の性質によって異なり、最も一般的なのは発色検出と蛍光検出です。発色免疫組織化学では、抗体はアルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に結合し、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）などの発色基質の存在下で発色反応を触媒します。^{[ 5 ]}発色生成物は通常の光学顕微鏡で分析できます。^{[ 13 ]}免疫蛍光では、抗体はフルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、アミノメチルクマリンアセテート、またはシアニン5などの蛍光色素に標識されます。Alexa Fluorsの合成蛍光色素もよく使用されます。^{[ 13 ] [ 14 ]}蛍光色素は蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で可視化できます。^{[ 13 ]}

発色法および蛍光検出法では、シグナルの濃度測定分析により、それぞれ半定量的および完全定量的なデータが得られ、レポーターシグナルのレベルとタンパク質の発現または局在のレベルとの相関関係が明らかになる。^{[ 6 ]}

標的抗原の免疫組織化学染色後、別の染色を施すことが多い。対比染色は、一次染色を際立たせ、組織形態の観察を容易にするコントラストを提供する。また、組織切片の方向付けと視覚化にも役立つ。ヘマトキシリンが一般的に使用される。^{[ 6 ] [ 15 ]}

免疫組織化学法では、組織の最終染色前にいくつかのステップがあり、さまざまな問題を引き起こす可能性があります。強いバックグラウンド染色、弱い標的抗原染色、およびアーチファクトの存在などが挙げられます。抗体の品質と免疫組織化学法を最適化することが重要です。^{[ 16 ]}内因性ビオチン、レポーター酵素、または一次/二次抗体の交差反応性は、強いバックグラウンド染色の一般的な原因です。^{[ 11 ] [ 13 ]}染色が弱い、または染色がない場合は、組織の固定が不正確であるか、抗原レベルが低いことが原因である可能性があります。免疫組織化学の組織調製と抗体染色のこれらの側面は、染色の問題を特定して克服するために体系的に対処する必要があります。^{[ 5 ] [ 6 ]}

バックグラウンド染色を除去する方法としては、一次抗体または二次抗体の希釈、インキュベーションの時間または温度の変更、異なる検出システムまたは異なる一次抗体の使用などがある。品質管理には、少なくとも抗原を発現することが知られている組織を陽性対照として、抗原を発現しないことが知られている組織を陰性対照として、また一次抗体を省略して（またはより良い方法として一次抗体を吸収して）同じ方法で検査した試験組織を含める必要がある。^{[ 5 ] [ 18 ]}

腫瘍生物学では、多くの潜在的な細胞内標的が存在する。多くの腫瘍はホルモン依存性である。ホルモン受容体の存在は、腫瘍が抗ホルモン療法に反応する可能性があるかどうかを判断するために使用できる。最初の治療法の1つは、乳がんの治療に使用される抗エストロゲン剤であるタモキシフェンであった。このようなホルモン受容体は、免疫組織化学によって検出できる。^{[ 23 ]} 細胞内チロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブは、特定の異常チロシンキナーゼの形成を特徴とする疾患である慢性骨髄性白血病の治療のために開発された。イマチニブは、他のチロシンキナーゼ、特にKITを発現する腫瘍に有効であることが証明されている。ほとんどの消化管間質腫瘍はKITを発現しており、これは免疫組織化学によって検出できる。^{[ 24 ]}

免疫組織化学によって病理学的状態で高度に上方制御されていることが示されている多くのタンパク質は、モノクローナル抗体を利用した治療の潜在的な標的である。モノクローナル抗体は、そのサイズのため、細胞表面の標的に対して使用される。過剰発現している標的の中には、細胞内チロシンキナーゼを制御する細胞外受容体ドメインを持つ膜貫通タンパク質であるEGFRファミリーのメンバーがある。 ^{[ 25 ]}これらのうち、HER2/neu（Erb-B2としても知られる）が最初に開発された。この分子は、さまざまな癌細胞タイプで高度に発現しており、最も顕著なのは乳癌である。そのため、HER2/neuに対する抗体は、ハーセプチンという薬名で癌の臨床治療薬としてFDAの承認を受けている。市販の免疫組織化学検査には、Dako HercepTest ^{[ 26 ]} 、 Leica Biosystems Oracle ^{[ 27 ]}、Ventana Pathway ^{[ 28 ]}がある。

同様に、上皮成長因子受容体（HER-1）は、頭頸部癌や結腸癌など、さまざまな癌で過剰発現しています。免疫組織化学は、エルビタックス（セツキシマブ）などの治療用抗体から恩恵を受ける可能性のある患者を特定するために使用されます。^{[ 29 ]}免疫組織化学によって上皮成長因子受容体を検出する市販システムには、Dako pharmDxなどがあります。^{[ 30 ]}