クロモジェニックin situハイブリダイゼーション

クロモジェニックin situハイブリダイゼーション( CISH ) は、免疫組織化学 (IHC)技術のクロモジェニック信号検出法とin situハイブリダイゼーションを組み合わせた細胞遺伝学的技術です。^{[1] [2]}これは、HER-2/neu がん遺伝子増幅の検出のための蛍光in situハイブリダイゼーション (FISH)の代替として 2000 年頃に開発されました。 ^[1] CISH は、DNA の特定領域の有無を検出するために使用されるin situハイブリダイゼーション技術であるという点で FISH に似ています。 ^[1]ただし、CISH は、FISH で使用されるより高価で複雑な蛍光顕微鏡ではなく、明視野顕微鏡を使用するため、診断ラボでははるかに実用的です。^{[1] [3]}

CISHのプローブ設計はFISHのものと非常によく似ており、ラベル付けと検出のみが異なります。FISHプローブは一般的にさまざまな蛍光タグでラベル付けされており、蛍光顕微鏡でのみ検出できます^[4]。一方、CISHプローブはビオチンまたはジゴキシゲニンでラベル付けされており^[5]、他の処理手順を適用した後、明視野顕微鏡で検出できます^{[1] 。}

CISHプローブは長さが約20ヌクレオチドで、DNAターゲット用に設計されています。これらはターゲット配列に相補的であり、変性およびハイブリダイゼーションのステップの後に結合します。市販されているCISHプローブはごくわずかであるため、ほとんどの用途では、細菌人工染色体（BAC）から抽出、増幅、配列決定、ラベル付け、マッピングする必要があります。^{[6] BACは}、ヒトゲノムプロジェクト中に開発されました。これは、配列決定のためにヒトDNAの短い断片を分離して増幅する必要があったためです。^[7]現在では、UCSCゲノムブラウザなどの公開データベースを使用して、BACを選択し、ヒトゲノム上に配置できます。^[6]これにより、最適な相補性と配列特異性が保証されます。DNAはBACクローンから抽出され、縮重オリゴヌクレオチドプライミング（DOP）-PCRなどのポリメラーゼベースの技術を使用して増幅されます。^[8]次に、クローンの配列が決定され、ゲノム上の位置が検証されます。^{[9]プローブの標識は、ランダムプライミングまたは}ニックトランスレーションを使用してビオチンまたはジゴキシゲニンを組み込むことによって行うことができます。^[10]

CISHが最適に機能するためには、染色体が間期または中期のいずれかにある必要があります。組織サンプルは、通常スライドガラスである表面にパラフィンでしっかりと固定されます。^[11]次に、ハイブリダイゼーションステップの前に、組織サンプルを数回洗浄して加熱し、パラフィンを除去する必要があります。この後、サンプルはペプシン消化を受け、ターゲットにアクセス可能であることを確認する必要があります。^[11]最後のステップとして、10～20 μLのプローブが追加され、サンプルがゴム糊で密封されたカバーガラスで覆われ、スライドが97 °Cで5～10分間加熱され、DNAが変性します。^[11]次に、プローブがハイブリダイズできるように、スライドを37 °Cのオーブンに一晩置きます。^{[11] [12]}翌日、サンプルを洗浄し、非特異的タンパク質結合部位のブロッカーを適用します。^[11]ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）を使用する場合は、サンプルを過酸化水素中でインキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制する必要があります。 ^[11]ジゴキシゲニンをプローブラベルとして使用した場合、抗ジゴキシゲニンフルオレセイン一次抗体に続いてHRP結合抗フルオレセイン二次抗体が適用されます。^[1]ビオチンをプローブラベルとして使用した場合、非特異的結合部位は最初にウシ血清アルブミン（BSA）を使用してブロックする必要があります。^[11]次に、HRP結合ストレプトアビジンを使用して検出します。^{[6] [11]}次に、HRPはジアミノベンジジン（DAB）を不溶性の茶色の生成物に変換します。これは、明視野顕微鏡で40〜60倍の倍率で検出できます。^{[11] [13]}ヘマトキシリンで軽く染色すると、生成物をより見やすくするために対比染色として使用できます。^[5]

FISH は感度が高く解像度が高いため、染色体異常検出のゴールドスタンダードと考えられています。^{[3] [14]}染色体異常検出用に開発された他の技術は、通常、FISH の感度と特異度と比較され、どの程度優れているかが調べられます。^{[3] [14]}たとえば、FISH と比較すると、CISH は HER-2/neu 遺伝子増幅の検出において感度 97.5%、特異度 94% であることが示されています。^[3] FISH と CISH の一致率は 94.8% であり、CISH は FISH に匹敵する技術であることを示しています。^[3]他のほとんどの情報源もこれに同意し、FISH と CISH の遺伝子増幅アッセイでほぼ同等のパフォーマンスを報告しています。^{[15] [16]}ただし、CISH は低レベルの増幅に対して感度が低くなることがあります。^[1]

CISH は、使用する試薬や機器の点で FISH よりも優れています。前述のように、CISH は蛍光顕微鏡ではなく明視野顕微鏡を使用するため、はるかに安価で使いやすいです。^{[1] [3]}さらに、CISH 試薬は FISH 試薬よりも安定しているため、サンプルを保存して同じサンプルを複数回検査することができます。^{[3] [14]} FISH 試薬は光退色により時間の経過とともに退色するため、サンプルは 1 回しか検査できません。^{[3] [14]}高価な蛍光顕微鏡とは別に、FISH では蛍光が退色する前にサンプルの顕微鏡写真を撮影するために高解像度のデジタルカメラも必要です。^[14]明視野顕微鏡を使用するもう 1 つの利点は、CISH では組織または細胞サンプル全体を視覚化できるのに対し、FISH では蛍光顕微鏡を使用して細胞形態を評価するのが難しいことです。^{[3] [14]}

CISHは、使用されるプローブと全体的な方法においてもFISHとは異なります。FISHプローブには、リピートプローブ、特定の遺伝子またはテロメアを検出するプローブ、染色体異常を検出するプローブなど、さまざまな種類があります。^[14]対照的に、市販されているCISHプローブの種類は限られており、3、7、8、9、10、11、17、18、X、Y染色体のセントロメアに結合するプローブや、HER-2、EGFR、MYC、TOP2Aなどの癌関連遺伝子の遺伝子特異的プローブなどがあります。^[14]利用可能なCISHプローブの種類は限られていますが、一般的にFISHプローブよりも費用対効果に優れています。^[14]全体的な方法に関して、FISHは直接標識（プローブに蛍光色素を付着させる）または間接標識（プローブをビオチンまたはジゴキシゲニンで標識し、それぞれ蛍光標識ストレプトアビジンまたは抗体を使用して検出する）を使用して実行できます。^{[14] CISHは、抗体またはストレプトアビジンをHRPや}アルカリホスファターゼ（AP）などの酵素に結合させる間接標識を使用して実行されます。^[14]

CISHとIHCは、どちらも同じ目的（主にHER-2/neu増幅の検出）で使用され、増幅を測定するために酵素反応（HRP/AP）を使用するという点で似ています。^[13] CISHとIHCの違いは、IHCがタンパク質発現を測定するのに対し、CISHはDNA増幅を測定することです。^[13]この違いは、遺伝子増幅がタンパク質発現よりも高い予後価値を持つことが判明しているため、HER-2/neuに特に役立ちます。^[17]

IHCの欠点は、偽陰性や偽陽性の結果を特定できないことです。^[17] CISHでは、参照プローブの信号がない場合、アッセイは失敗となります。

低タンパク質過剰発現/遺伝子増幅と高タンパク質過剰発現/遺伝子増幅の場合、CISHとIHCはそれぞれ86％以上と89％以上の一致率を示しています。^[18]モノクローナル抗体はより特異的に結合するため、IHCとCISHの両方でポリクローナル抗体よりも検出に優れていることが示されており、一致率も高くなります。^[18]

中程度のタンパク質過剰発現/遺伝子増幅の一致率は変動しますが、モノクローナル抗体を使用した場合の方がポリクローナル抗体を使用した場合よりも高くなります。^[18]一致率が変動するのは、遺伝子増幅がタンパク質発現と厳密に相関しておらず、腫瘍の異質性により組織内のタンパク質過剰発現を検出することが困難になる可能性があるためです。^[18]

CISHは、乳がんサンプル中のHER-2/neu状態などの遺伝子増幅を評価するために頻繁に適用されています。^{[2] [19]} HER-2/neu増幅は、乳がんの死亡率の上昇、再発率の上昇、予後不良と関連しています。^[20]モノクローナル抗体トラスツズマブは、HER-2/neu過剰発現腫瘍に臨床的に非常に有効であることが証明されている受容体遮断薬です。^[21]したがって、がん治療を開始する前に受容体の状態を決定することが重要です。^[21]

CISHは、肺癌におけるALKチロシンキナーゼドメインとEML4のプロモーターおよび5'領域との融合など、染色体再編成および融合の検出にも使用されます。ALK陽性腫瘍は、ALK阻害剤クリゾチニブで非常に効果的に治療できるため、臨床的に関連するサブグループです。^{[22] [23]}

がん以外にも、CISHはヒトパピローマウイルス感染の検出にも有用であることが示されています。^[24]

SISH は CISH と同様の方法を使用するが、最終生成物は茶色の生成物ではなく銀沈殿物である。^{[25]この方法では、}ジニトロフェノール (DNP)でタグ付けされたプローブがターゲット配列に結合します。^[25]次に、一次抗 DNP 抗体を添加し、続いて HRP に結合した二次抗体を添加します。^[25]次に、酢酸銀、ハイドロキノン、過酸化水素を二次抗体に添加し、HRP は過酸化水素の存在下で銀の重合を触媒します。^[25]その結果、銀金属が細胞の核に沈着します。^[25] HER-2/neu の増幅は黒い点として見られます。^[25]

DuoCISHはCISHのバリエーションで、同じスライド上に2つの異なるプローブが必要であるというニーズに応えます。^[26]これはHER-2/neu増幅検出のための確立された技術ですが、FISHよりも効果が低いと報告されることもあります。^[27]この技術では、1つのプローブが参照（HER-2/neu増幅検出の場合はCEN17（17番染色体のセントロメア））に結合し、もう1つのプローブが標的配列（HER-2/neu）に結合します。^{[26] [27]} DuoCISHは、FISHプローブからの信号を発色基質に変換するという点で、FISHとCISHの両方を兼ね備えています。^{[26] [27]}これは、青色シアニン色素がHRPの基質であり、赤色色素がAPの基質であるという原理に基づいて機能します。例えば、緑色のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）シグナルは、HRPに結合した抗FITC抗体を介して青色の発色沈殿物に変換され、テキサスレッドシグナルは、APに結合した抗テキサスレッド抗体を介して赤色の発色沈殿物に変換されます。^{[26] [27]} DuoCISHの利点は、染色体異数性と遺伝子増幅を区別できることです。これは、参照遺伝子も異数性では増幅されますが、遺伝子増幅検出では増幅されないためです。^{[26] [27]}