大腸菌T4

大腸菌T4ウイルスは、大腸菌に感染するバクテリオファージの一種です。ストラボウイルス科テベンウイルス亜科に属する二本鎖DNAウイルスです。T4は溶菌性生活環のみを経ることができ、溶原性生活環は経ることができません。この種は以前は T-evenバクテリオファージと呼ばれていましたが、この名称には、腸内細菌ファージT2、腸内細菌ファージT4 、腸内細菌ファージT6などの株（または分離株）も含まれていました。

1940年代に遡り、今日まで続いているT偶数ファージは、最もよく研​​究されているモデル生物と考えられています。T偶数ファージは、約300個の遺伝子から構成される、最大かつ最も複雑なウイルスの1つです。T偶数ウイルスは、 DNAの一部としてシトシンの代わりにヒドロキシメチルシトシン（HMC）も使用します。^{[ 5 ]}

T4ウイルスの二本鎖DNAゲノムは約169kbpの長さで^{[ 6 ]}、289個のタンパク質をコードしている。T4ゲノムは末端冗長である。DNA複製時に、おそらくローリングサークル複製機構によって、長いマルチゲノム長の連結体が形成される^{[ 7 ]。}パッケージ化されると、連結体は同じ長さの非特異的な位置で切断され、元のゲノムの環状順列を表す複数のゲノムが生成される^{[ 8 ]} 。T4ゲノムは真核生物のようなイントロン配列を持っている。

T4は比較的大きなウイルスで、幅約90 nm、長さ約200  nmです（ほとんどのウイルスは 長さが25～200 nmです）。DNAゲノムは正二十面体の頭部、別名カプシドに保持されています。^{[ 10 ]} T4の尾部は中空になっており、付着後に感染細胞に核酸を送り込むことができます。T4のようなミオウイルス科のファージは、尾部の構築と機能に関与する多数のタンパク質を含む複雑な収縮性尾部構造を持っています。^{[ 11 ]}尾部繊維は宿主細胞表面受容体の認識にも重要であり、細菌がウイルスの宿主範囲内にあるかどうかを判断します。^{[ 12 ]}

13種類のタンパク質（遺伝子産物5、5.4、6、7、8、9、10、11、12、25、27、48、53）の127本のポリペプチド鎖からなる6メガダルトンのT4基底板の構造が最近、原子レベルで詳細に記述された。gp54とメインチューブタンパク質gp19によって形成される尾管の近位領域の原子モデルも作成された。テープメジャータンパク質gp29は基底板-尾管複合体中に存在するが、モデル化できなかった。^{[ 13 ]}

バクテリオファージ（ファージ）T4ビリオンの組み立て中、ファージ遺伝子によってコードされる形態形成タンパク質は特徴的な順序で互いに相互作用します。ウイルス感染中に産生されるこれらのタンパク質のそれぞれの量の適切なバランスを維持することは、正常なファージT4形態形成にとって重要であると考えられます。^{[ 14 ]} ファージT4によってコードされるビリオン構造を決定するタンパク質には、主要構造成分、マイナー構造成分、および形態形成シーケンスの特定のステップを触媒する非構造タンパク質が含まれます。^{[ 15 ]}ファージT4の形態形成は、YapとRossmanによって詳細に説明されているように、頭部、尾部、および長い尾部線維の3つの独立した経路に分けられます。^{[ 16 ]}

T4ウイルスは、長い尾部線維（LTF）で大腸菌細胞表面のOmpCポリンタンパク質とリポ多糖（LPS）に結合することで大腸菌感染を開始します。 ^{[ 17 ] [ 18 ]}認識シグナルがLTFを介して基底板に送られます。これにより、大腸菌細胞表面に不可逆的に結合する短い尾部線維（STF）がほどけます。基底板の構造が変化し、尾部鞘が収縮し、尾管の先端にあるGP5が細胞の外膜を突き破ります。 ^{[ 19 ]} GP5のリゾチームドメインが活性化され、ペリプラズムのペプチドグリカン層を分解します。残りの膜部分が分解され、ウイルスの頭部からのDNAが尾管を通って大腸菌細胞内に入ることができます。

1952年、ハーシーとチェイス^{[ 20 ]}は、ファージDNAがタンパク質とは異なり、感染時に宿主細菌細胞に入り込み、ファージの遺伝物質となるという重要な証拠を提示した。この発見は、DNAが一般的に様々な生物の遺伝物質であることを示唆した。

再生

溶菌性ライフサイクル（細菌への侵入から破壊まで）は約30分（37  ℃の場合）かかります。病原性バクテリオファージは、侵入後すぐに細菌宿主内で増殖します。子孫ファージの数が一定量に達すると、宿主を溶解または破壊し、放出されて新しい宿主細胞に感染します。^{[ 21 ]}宿主の溶解と放出のプロセスは溶菌サイクルと呼ばれます。溶菌サイクルは、感染した細胞とその膜の破壊を伴うウイルスの複製サイクルです。このサイクルでは、ウイルスが宿主細胞とその機構を乗っ取って複製します。したがって、ウイルスが複製して宿主細胞に感染するには、5つの段階を経る必要があります。

• 吸着と浸透（即時開始）
• 宿主遺伝子発現の停止（即時開始）
• 酵素合成（5分後から開始）
• DNA複製（10分後から開始）
• 新たなウイルス粒子の形成（12分後から開始）

ライフサイクルが完了すると、宿主細胞が破裂し、新たに合成されたウイルスを環境中に放出し、宿主細胞を破壊する。T4ウイルスは、感染した宿主1匹あたり約100～150個のウイルス粒子を放出する。

ベンザー（1955～1959年）は、 rIIA遺伝子とrIIB遺伝子に欠陥のあるバクテリオファージT4変異体を用いて遺伝子の微細構造を研究するシステムを開発した。 ^{[ 22 ] [ 23 ] [ 24 ]} 使用された技術は、相補性試験と交配で、特に欠失変異間の組換えを検出した。これらの遺伝学的実験により、遺伝子内に変異部位の独特な直線的な順序が発見された。この結果は、遺伝子が独立して変異できる多くの部位を持つDNAの長さに相当する直線構造を持っているという重要な考えを強く裏付ける証拠となった。

吸着と浸透

他のすべてのウイルスと同様に、偶数ファージも宿主の表面にランダムに付着するのではなく、宿主の表面にある特定のタンパク質構造である受容体を「探し出して」結合します。これらの受容体はファージによって異なり、テイコ酸、細胞壁タンパク質、リポ多糖、鞭毛、線毛はすべてファージが結合する受容体として機能します。偶数ファージが宿主に感染してライフサイクルを開始するには、最初の感染プロセスである細菌細胞へのファージの吸着を経る必要があります。吸着はファージと宿主のペアに特徴的な値であり、宿主細胞表面へのファージの吸着は、可逆的および不可逆的な2段階のプロセスとして示されます。これは、ファージの尾部構造が関与しており、ファージの尾部繊維が宿主の適切な受容体へのファージの結合を助けるときに始まります。このプロセスは可逆的です。基底板の構成要素の1つ以上が、ファージと細菌の結合という可逆的なプロセスを媒介する。

侵入は、ファージの遺伝物質を細菌内部に注入するファージ宿主感染の重要な特徴でもある。核酸の侵入は、不可逆的な吸着段階の後に起こる。ファージの核酸の侵入に関わるメカニズムは、ファージごとに異なる。この侵入メカニズムには、電気化学的膜電位、ATP分子、ペプチドグリカン層の酵素的分解、またはこれら3つの因子すべてが、細菌細胞内への核酸の侵入に不可欠となる可能性がある。T2バクテリオファージ（T4様ファージ）の侵入メカニズムに関する研究が行われており、ファージの尾部は細菌細胞壁内部に侵入せず、このファージの侵入には内膜上の電気化学的膜電位が関与することが示されている。 ^{[ 25 ] [ 26 ]}

ウイルスT4ゲノムは、ローリングサークル複製を使用して宿主細胞内で合成されます。^{[ 7 ]} 生細胞でのDNA複製にかかる時間は、ウイルス感染した大腸菌におけるウイルスT4 DNA伸長速度として測定されました。^{[ 27 ]} 37℃での指数関数的DNA増加期間中 、その速度は毎秒749ヌクレオチドでした。ウイルスT4 DNA合成中の複製あたりの塩基対あたりの突然変異率は10⁻⁸あたり1.7であり^、 [ ^{28 ] 300}コピーで1つのエラーしかない非常に正確なDNAコピー機構です。ウイルスはまた、独自のDNA修復機構をコードしています。^{[ 29 ]} T4ファージヘッドは、後に分解される足場タンパク質の周りに空で組み立てられます。したがって、DNAは小さな孔を通ってプロヘッドに入る必要があります。これは、モーターおよびヌクレアーゼとしても機能するgp17の六量体が最初にDNAと相互作用することによって達成されます。 T4 DNAパッケージングモーターは、1秒あたり最大2000塩基対の速度でウイルスキャプシドにDNAをロードすることがわかっています。その動力は、サイズを大きくすると、平均的な自動車エンジンの動力に匹敵します。^{[ 30 ]}

ウイルスの複製と増殖の最終段階は、宿主細胞からのウイルス粒子の放出によって決まります。ウイルス粒子の放出は、細菌の細胞膜が破壊された後に起こります。エンベロープを持たないウイルスは、ウイルス蛋白質がペプチドグリカンまたは細胞膜を攻撃することによって宿主細胞を溶解します。細菌の溶解は、細胞内のカプシドが細胞壁を分解する酵素リゾチームを放出することによって起こります。放出されたバクテリオファージは他の細胞に感染し、ウイルスの増殖サイクルはそれらの細胞内で繰り返されます。

多重再活性化（MR）とは、それぞれ不活性化ゲノム損傷を含む2つ以上のウイルスゲノムが、感染細胞内で相互作用して生存可能なウイルスゲノムを形成するプロセスである。サルバドール・ルリアは、1946年に紫外線照射されたウイルスT4を研究中にMRを発見し、観察された損傷ウイルスの再活性化は組換え機構によって起こると提唱した（参考文献^{[ 31 ] [ 32 ] [ 33 ]}を参照）。これは、1952年にハーシー・チェイス実験によって関連ウイルスT2の遺伝物質としてDNAが確認される以前のことである。^{[ 20 ]}

ルリア（1984、^{[ 34 ]} p. 97）が回想しているように、放射線照射されたウイルスの再活性化（「多重再活性化」と呼ばれる）の発見は、初期のファージ群における放射線損傷の修復の研究をすぐに活発化させた（1981年にバーンスタイン^{[ 29 ]}がレビュー）。後に、ルリアが発見した相互援助による損傷したウイルスの修復は、DNA修復の特殊なケースの1つにすぎないことが判明した。細菌とそのウイルスだけでなく、研究されたすべての生物（ヒトを含む）のあらゆる種類の細胞は、DNA損傷を修復するための複雑な生化学的プロセスを持っていることが現在では知られている（DNA修復を参照）。DNA修復プロセスは、老化、癌、不妊症から身を守る上で重要な役割を果たしていることも現在では認識されている。

MR は通常、「生存曲線」で表され、多重感染細胞 (多重複合体) のプラーク形成能力の生存がゲノム損傷剤の線量に対してプロットされます。比較のために、単一感染細胞 (単一複合体) のウイルス プラーク形成能力の生存もゲノム損傷剤の線量に対してプロットされます。上の図は、紫外線の線量増加に伴うウイルス T4 多重複合体と単一複合体の生存曲線を示しています。生存は対数スケールでプロットされているため、多重複合体の生存が単一複合体の生存を (線量に応じて) 非常に大きな係数で上回っていることは明らかです。多重複合体の UV 不活化曲線には、初期に肩があります。多重複合体の生存曲線に肩がある他のウイルス T4 DNA 損傷剤は、X 線^{[ 35 ] [ 36 ]}およびエチルメタンスルホン酸 (EMS) ^{[ 29 ]}です。肩の存在は、2 つの組換えプロセスが使用されていることを意味すると解釈されています。^{[ 37 ]}最初の経路は（「肩」の部分で）DNAを高効率で修復しますが、損傷が増加するにつれてその能力は飽和します。2番目の経路はあらゆるレベルの損傷で機能します。マルチコンプレックスから放出された生存T4ウイルスは突然変異の増加を示さず、UV照射されたウイルスのMRが正確なプロセスであることを示しています。^{[ 37 ]}

下の図は、DNA損傷剤マイトマイシンC （MMC）によるT4ウイルスの不活化に対する生存曲線を示しています。この場合、多重複合体の生存曲線には初期の肩がなく、上記の2番目の組換え修復プロセスのみが活性であることを示唆しています。このプロセスによる修復の効率は、1,000個の単一複合体のうち1個しか生存しないMMCの投与量で、多重複合体の約70%が生存するという観察によって示されています。同様の多重複合体生存曲線（肩なし）は、DNA損傷剤P32分解、ソラレン＋近紫外線照射（PUVA）、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG）、メチルメタンスルホン酸（MMS）、亜硝酸についても得られました。^{[ 29 ]}

ウイルスT4のMRに必要な遺伝子のいくつかは、原核生物、真核生物、古細菌の組換えに必須な遺伝子のオルソログであることが判明した。これには、例えば、大腸菌のRecAおよび真核生物の相同タンパク質RAD51 、古細菌のRadAと三次元構造相同性を持つタンパク質をコードするT4遺伝子uvsX [ ^{38 ]が}含まれる。MR中のDNA損傷の効率的かつ正確な組換え修復は、真核生物の減数分裂中に起こる組換え修復プロセスに類似している可能性があると示唆されている。^{[ 39 ]}

バクテリオファージは、1915年にイギリスの科学者フレデリック・トワート、1917年にフェリックス・デレルによって初めて発見されました。 1930年代後半、T.  L. ラキエテンは、未処理の下水混合物、または未処理の下水に感染した大腸菌の溶解物を、2人の研究者ミリスラフ・デメレックとウーゴ・ファノに提案しました。この2人の研究者は、大腸菌からT3、T4、T5、T6を分離しました。また、1932年には、研究者J. ブロンフェンブレンナーがT2ファージを研究し、ウイルスからT2ファージを分離しました。^{[ 40 ]}この分離は、下水ではなく糞便材料から行われました。いずれにせよ、マックス・デルブリュックはT偶数ファージの発見に関わっていました。彼の役割は、バクテリオファージをタイプ1（T1）、タイプ2（T2）、タイプ3（T3）などに命名することだった。

T4ウイルスの分離の具体的な時期と場所は不明のままだが、下水や糞便から発見された可能性が高い。T4および類似のウイルスは、 1944年11月にトーマス・F・アンダーソン、マックス・デルブリュック、ミリスラフ・デメレックの論文で記述された。 ^{[ 42 ]} 1943年、サルバドール・ルリアとデルブリュックは、細菌のファージ耐性変異は選択に対する反応ではなく、選択がない状態で発生することを示した。 ^{[ 34 ]} 1943年以前の細菌学者の伝統的な見解は、細菌には染色体も遺伝子もないというものだった。ルリアとデルブリュックの実験は、細菌は他の確立されたモデル遺伝生物と同様に遺伝子を持ち、これらの遺伝子が自然に変異して変異体を生成し、それが複製してクローン系統を形成する可能性があることを示した。同年、彼らは別のファージ実験者であるアルフレッド・ハーシーとも共同研究を開始した。^{[ 43 ]}（この3人は「ウイルスの複製機構と遺伝学に関する研究」で1969年のノーベル生理学・医学賞を共同受賞した。）

ファージグループは、マックス・デルブリュックを中心とした生物学者の非公式なネットワークであり、主にバクテリオファージT4に関する基礎研究を行い、20世紀半ばに微生物遺伝学と分子生物学の起源に数多くの重要な貢献をした。1961年、ファージグループの初期メンバーであるシドニー・ブレナーは、ケンブリッジのキャベンディッシュ研究所でフランシス・クリック、レスリー・バーネット、リチャード・ワッツ＝トービンと共同で、タンパク質の遺伝暗号の基本的な性質を示す遺伝実験を行った。^{[ 44 ]} ファージT4のrIIB遺伝子の変異体を用いて行われたこれらの実験は、タンパク質をコードする遺伝子の場合、遺伝子のDNAの3つの連続する塩基が、タンパク質の各連続するアミノ酸を指定することを示した。したがって、遺伝暗号はトリプレットコードであり、各トリプレット（コドンと呼ばれる）が特定のアミノ酸を指定する。彼らはまた、タンパク質をコードするDNA配列においてコドンが互いに重複しないこと、そしてそのような配列は固定された開始点から読み取られるという証拠も得た。

1962年から1964年にかけて、ファージT4の研究者たちは、実験室条件下でファージの増殖に不可欠なほぼすべての遺伝子の機能を研究する機会を得た。^{[ 45 ] [ 46 ]}これらの研究は、2種類の条件付き致死変異体 の発見によって促進された。このような変異体の1つはアンバー変異体として知られている。^{[ 47 ]}もう1つの条件付き致死変異体は温度感受性変異体 と呼ばれている。^{[ 48 ]} これら2種類の変異体の研究は、数多くの基本的な生物学的問題に対するかなりの洞察をもたらした。このようにして、DNA複製、修復、および組換えの機構で使用されるタンパク質の機能と相互作用、およびウイルスがタンパク質と核酸成分からどのように組み立てられるか（分子形態形成）についての理解が得られた。さらに、鎖終結コドンの役割が解明された。注目すべき研究の1つは、ファージT4の主要ヘッドタンパク質をコードする遺伝子に欠陥のあるアンバー変異体を使用した。^{[ 49 ]} この実験は、広く信じられていたものの、1964年以前にはまだ証明されていなかった「配列仮説」、すなわちタンパク質のアミノ酸配列は、そのタンパク質を決定する遺伝子のヌクレオチド配列によって規定されるという仮説を強く裏付ける証拠を提供した。したがって、この研究は、遺伝子とそれがコードするタンパク質の共線性を実証した。

マックス・デルブリュック、サルバドール・ルリア、アルフレッド・ハーシー、ジェームズ・D・ワトソン、フランシス・クリックなど、多くのノーベル賞受賞者がウイルスT4またはT4様ウイルスの研究に携わった。ウイルスT4の研究に携わったその他の重要な科学者には、マイケル・ロスマン、シーモア・ベンザー、ブルース・アルバート、ギゼラ・モシグ、^{[ 50 ]}リチャード・レンスキー、ジェームズ・ブルなどがいる。

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• T4バクテリオファージが大腸菌に感染するアニメーション
• T4バクテリオファージDNAパッケージングのアニメーション