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クロストリジオイデス・ディフィシル毒素A（ TcdA）は、以前はクロストリジウム・ディフィシルとして知られていた細菌クロストリジオイデス・ディフィシルによって産生される毒素です。 [ 1 ]これはクロストリジオイデス・ディフィシル毒素Bに似ています。これらの毒素は、グラム陽性の嫌気性細菌[ 2 ]であるクロストリジオイデス・ディフィシルによって産生される主な病原性因子です。これらの毒素は腸粘膜を損傷し、偽膜性大腸炎を含むC. difficile感染症の症状を引き起こすこと。
TcdAは、既知の細菌毒素の中で最大級のものです。分子量は308 kDaで、通常は強力な腸管毒素として説明されますが[ 3 ]、細胞毒素としての活性も多少あります[ 4 ]。この毒素は、宿主細胞のGTPaseタンパク質をグルコシル化によって修飾することで作用し、細胞活動の変化を引き起こします。C . difficile感染症のリスク要因には、正常な腸内細菌叢を破壊し、 C. difficile細菌の定着につながる可能性のある抗生物質治療が含まれます[ 5 ] 。
この遺伝子には、2,710個のアミノ酸をコードする8,133ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれています。TcdAとTcdBは、アミノ酸配列において63%の相同性を共有しています。[ 6 ]これらの遺伝子は、環境要因に応じて、対数増殖後期および定常期に発現します。抗生物質やカタボライト抑制などの環境ストレスは、毒素の発現に影響を与える可能性があります。[ 7 ]
tcdAおよびtcdB遺伝子は、 C. difficileの毒素産生株にのみ存在する19.6 kb の病原性遺伝子座(PaLoc) 内のClostridioides difficile染色体上に位置しています。毒素を産生しない株は、 PaLoc の代わりに 127 塩基対の断片を含んでいます。[ 8 ]この遺伝子座には、tcdC、tcdR、およびtcdEという他の 3 つの補助遺伝子も含まれています。[ 9 ] TcdC の発現は、指数関数的増殖の初期段階で高く、増殖が定常期に移行するにつれて低下し、 tcdAおよびtcdBの発現の増加と一致しています。したがって、発現パターンは、 tcdC が毒素産生の負の調節因子である可能性を示唆しています。tcdRは毒素産生の正の調節因子として機能する可能性があります。[ 7 ] tcdE は、細菌細胞膜上の溶解活性を介して TcdA および TcdB の放出を促進すると推測されています。 tcdEは、同様の機能を持つ他のタンパク質との相同性、およびtcdAとtcdBの間に遺伝子が存在することから、TcdAとTcdBには分泌シグナルペプチドがないため、tcdEは放出を促進する溶解性タンパク質として機能すると予測される。[ 8 ]
このタンパク質は3つのドメインから構成されている。アミノN末端ドメインには、毒素のグルコシル化活性を担う活性部位が含まれている。TcdAとTcdBはどちらも、この高度に保存されたN末端領域（両毒素間で74%の相同性）を利用して同一の基質を変化させる。[ 7 ]
カルボキシC末端ドメインには、標的細胞表面の受容体結合に関与する繰り返し単位が含まれています。これらの短い相同繰り返し単位は、複合繰り返しオリゴペプチド（CROP）と呼ばれています。[ 7 ] [ 10 ]最近の研究では、CROPが細胞表面の構造との相互作用を通じてTcdAの効力を決定することが示されています。[ 11 ]これらのCROP領域は21～50残基の範囲であり、受容体結合に役割を果たします。[ 7 ]このC末端繰り返し領域は、この領域に特異的なモノクローナル抗体によってリガンド結合が阻害されるため、免疫優性領域として指定されています。[ 12 ] [ 13 ]この領域には、分子の中で最も親水性の高い部分が含まれています。 [ 10 ]
中央に位置する疎水性ドメインには、高度に保存された172個の疎水性アミノ酸のクラスターが含まれており、タンパク質の酵素部分の転座に重要であると考えられている。[ 5 ] [ 6 ]
TcdAは細胞質に到達するためにエンドサイトーシスを介して宿主細胞内に取り込まれる必要がある。受容体結合は酸性エンドソーム内でのエンドサイトーシスによる細胞内への侵入に必要な最初のステップである。[ 6 ]エンドソーム内の低pHは、TcdAの機能に不可欠な疎水性ドメインの露出などの構造変化を誘発する。[ 7 ] [ 14 ]
TcdAのN末端ドメインは、UDP-グルコースからグルコース分子を転移させ、それを標的分子の保存アミノ酸に共有結合させるグルコトランスフェラーゼ反応を触媒する機能を持つ。[ 6 ]したがって、TcdAは、 Rasファミリーの低分子GTPaseの標的分子のグルコシル化とそれに続く不可逆的な不活性化を触媒する。[ 9 ]これらの標的分子には、真核生物のアクチン細胞骨格の調節タンパク質であり、さまざまな細胞シグナル伝達経路の調節因子であるRhoA、Rac、およびCdc42が含まれる。 [ 7 ]
TcdAは主にRho、Rac、Cdc42を標的とする。これらの分子は細胞シグナル伝達の重要な調節因子である。Rho、Rac、Cdc42などの低分子GTPアーゼは、活性なGTP結合状態と不活性なGDP結合状態を交互に切り替えることで活性を調節する。[ 7 ]グアニン交換因子（GEF）はGTPとGDPの交換を調節する。[ 15 ]
TcdAは、ヌクレオチド糖であるUDP-グルコースからグルコース分子をRhoA GTPaseのThr-37に転移させることでRhoAをグルコシル化する。RacとCdc42では、糖部分はThr-35に転移される。グルコシル化によりGTPの適切な結合が阻害され、活性化がブロックされる。[ 7 ] TcdAは、GTPaseタンパク質のGDP結合型に優先的に作用する。これは、この構成では毒素によってグルコシル化されるスレオニン残基が露出するためである。 [ 5 ]
RhoAはアクチン細胞骨格を調節し、ストレスファイバーと焦点接着を形成します。[ 16 ] RhoAがTcdAによって不活性化されると、下流のエフェクターとの相互作用が阻害されます。これにより、腸上皮の透過性を高めるアクチン細胞骨格の変化が引き起こされます。RacとCdc42は、運動と細胞移動に不可欠なフィロポディウム形成に関与しています。全体として、Rho、Rac、およびCdc42はすべて、アクチン重合に依存する細胞内のプロセスを調節します。TcdAに曝露された後に細胞が経験する生理学的効果の多くは、アクチン重合の調節異常とTcdAの標的によって制御される細胞経路に関連している可能性があります。[ 7 ]
TcdAへの曝露は、線状アクチン（ F-アクチン）の減少と球状アクチンの増加による構造的完全性の喪失など、細胞形態の即時的な変化を引き起こします。[ 17 ]アクチンフィラメントと細胞骨格の乱れは、タイトジャンクションの透過性の増加につながり、上皮細胞の重度の損傷と体液の分泌を引き起こします。[ 18 ] [ 19 ]体液の蓄積と分泌は、TcdAへの曝露後に発生する粘膜損傷の二次的なものです。マイクロフィラメントシステムの明確な変化は、細胞の丸みと細胞死につながります。[ 17 ]これらの変化は、タイトジャンクションの調節に重要な役割を果たすRhoタンパク質の不活性化に起因します。[ 7 ] [ 20 ]
TcdAに曝露された細胞の死因として最も可能性が高いメカニズムはアポトーシスである。Rhoの不活性化は、アポトーシス経路の2つの主要構成要素であるカスパーゼ-3とカスパーゼ-9を活性化する。TcdAは、カスパーゼの活性化とRhoの不活性化を介してミトコンドリア膜の破壊とシトクロムCの放出に関与しており、TcdAがアポトーシスを誘導する能力があることをさらに示唆している。[ 21 ] [ 22 ]
動物モデルでは、TcdAが下痢、好中球浸潤、腸粘膜の炎症、上皮細胞の壊死を引き起こすことが示されている。この毒素はCDADの主な原因と考えられている。[ 18 ] TcdAは腸絨毛先端を損傷し、刷子縁膜を破壊し、細胞の侵食と損傷部位からの体液漏出を引き起こす。この損傷とそれに伴う体液反応が、クロストリジオイデス・ディフィシル感染症に伴う下痢を引き起こす。[ 17 ]
TcdAは、 C. difficile関連偽膜性大腸炎（PMC）で起こる生理学的変化を誘発する可能性があり、これは大腸の重度の潰瘍です。毒素による大腸粘膜の損傷は、フィブリン、ムチン、および死細胞の蓄積を促進し、大腸内にデブリ層（偽膜）を形成し、炎症反応を引き起こします。[ 5 ] TcdAによる損傷は、上皮透過性の増加、サイトカインおよびケモカインの産生、好中球の浸潤、活性酸素種（ROS）の産生、肥満細胞の活性化、および腸粘膜への直接的な損傷を引き起こします。 [ 23 ]これらはすべて、TcdAによって誘発されるRho GTPaseタンパク質の不活性化に起因する可能性があります。 [ 20 ]タイトジャンクションの喪失は、好中球が腸管に侵入することを可能にし、好中球の蓄積につながります。これはPMCの特徴です。 TcdA誘導性IL-8およびその他の炎症性メディエーターのサイトカイン産生は、PMCに見られる炎症段階に寄与する。TcdA損傷に対する好中球、マクロファージ、および肥満細胞の浸潤は、腫瘍壊死因子α、IL-1、IL-6、およびその他のモノカインなどの他のメディエーターの産生と放出を通じて炎症反応を増加させる。これらのメディエーターは腸粘膜にさらなる損傷を与え、炎症反応をさらに増加させ、PMCの持続に影響を与える。[ 24 ]腸壁に広範囲の損傷が発生すると、細菌が血流に入り込み、敗血症性ショックおよび死を引き起こす可能性がある。[ 5 ]
TcdAとTcdBはC. difficile培養の上清液中に存在し、濾液から精製することができる。両毒素はヒトおよび動物の糞便サンプルで一貫して検出され[ 25 ] 、現在ではC. difficile感染症の診断マーカーとして使用されている[ 7 ] 。C . difficileに感染した患者の90%以上が糞便中に細胞毒性活性を有することが判明した。Rho GTPaseのグルコシル化はGTPaseタンパク質を不活性化し、細胞骨格の崩壊を引き起こし、細胞の丸化をもたらす。糞便サンプル中のC. difficile毒素を検出するために組織培養アッセイが開発されている[ 17 ] 。C. difficile感染症を診断するために細胞丸化アッセイ（細胞毒性アッセイ）が開発されている[ 11 ]。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、特異抗体を用いてTcdAおよびTcdBを検出するために使用されている。 ELISAと併用する場合、細胞毒性アッセイはC. difficileの診断のためにVero細胞で使用する際の「ゴールドスタンダード」である。[ 11 ]
1980年代から1990年代初頭にかけて、 C. difficile 感染における TcdA と TcdB の役割については多くの議論がなされてきた。精製された毒素を用いた以前の報告では、TcdA 単独で感染症状を引き起こすのに十分であり、TcdB は TcdA と組み合わせない限り感染症状を引き起こすことができないと示されていた。 [ 7 ]より最近の実験では、TcdB が実際には病原性に必須であることが示された。[ 26 ]以前の研究では、TcdA は厳密に腸管毒素、TcdB は細胞毒素であると確立されていたが、後に両方の毒素が同じ作用機序を持つことが判明した。[ 6 ] C. difficile感染の病原性における両方の毒素の役割を完全に調査するために、ハムスター感染モデルで遺伝子ノックアウトシステムが開発された。tcdA、tcdB、またはその両方を永久的にノックアウト（ダブルノックアウト）することで、一方または両方の毒素を産生するC. difficileが細胞毒性活性を有することが示され、この活性はin vivoでの病原性に直接結びついた。また、 tcdAtcdBのダブルノックアウトでは病原性が完全に減弱することもわかった。全体として、この研究はC. difficile感染におけるTcdAとTcdBの両方の重要性を示し、どちらの毒素も細胞毒性を有することを示した。[ 9 ]