融合タンパク質

融合タンパク質またはキメラ(kī-ˈmir-ik)タンパク質(文字通り、異なるソースに由来する部分から作られる) は、もともと別々のタンパク質をコードしていた2 つ以上の遺伝子を結合することによって作成されるタンパク質です。この融合遺伝子の翻訳により、元の各タンパク質に由来する機能特性を持つ1 つまたは複数のポリペプチドが生成されます。組み換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療に使用するために、組み換え DNA 技術によって人工的に作成されます。キメラまたはキメラは通常、異なる機能または物理化学的パターンを持つポリペプチドから構成されるハイブリッド タンパク質を指します。キメラ変異タンパク質は、染色体転座、縦列重複、またはレトロ転座などの複雑な変異によって、2 つの異なる遺伝子のコード配列の一部を含む新しいコード配列が作成された場合に自然に発生します。自然発生的な融合タンパク質は、がん細胞によく見られ、腫瘍タンパク質として機能する場合があります。 bcr -abl融合タンパク質は、発癌性融合タンパク質のよく知られた例であり、慢性骨髄性白血病の主な発癌因子であると考えられています。

一部の融合タンパク質はペプチド全体を組み合わせるため、元のタンパク質のすべての機能ドメインを含みます。ただし、他の融合タンパク質、特に自然に発生する融合タンパク質は、コード配列の一部のみを組み合わせるため、融合タンパク質を形成した親遺伝子の元の機能は維持されません。

完全な遺伝子融合の多くは完全に機能し、元のペプチドを置き換える働きをします。しかし、一部の遺伝子融合では、2 つのタンパク質間の相互作用により、その機能が変化することがあります。これらの影響以外にも、一部の遺伝子融合は、これらの遺伝子が作用する時期と場所を変える調節的変化を引き起こす可能性があります。部分的な遺伝子融合では、異なる活性部位と結合ドメインのシャッフルにより、新しい機能を持つ新しいタンパク質が生まれる可能性があります。

宿主細胞内のタンパク質への蛍光タグの融合は、リアルタイムでタンパク質相互作用を追跡するために実験細胞および生物学研究で広く使用されている技術です。最初の蛍光タグである緑色蛍光タンパク質(GFP) は、オワンクラゲから単離され、現代の研究で今でも頻繁に使用されています。より最近の派生としては、花虫綱から最初に単離された光変換蛍光タンパク質 (PCFP) があります。最も一般的に使用されている PCFP はKaede蛍光タグですが、2005 年に Kikume 緑赤 (KikGR) が開発され、より明るい信号とより効率的な光変換が提供されています。PCFP 蛍光タグを使用する利点は、重複する生化学経路の相互作用をリアルタイムで追跡できることです。タンパク質が経路内の目的のポイントに到達すると、タグの色が緑から赤に変わり、交互に変化するタンパク質を経路の期間中監視できます。この技術は、G タンパク質共役受容体(GPCR) のリサイクル経路を研究する場合に特に便利です。リサイクルされたGタンパク質受容体の運命は、緑色の蛍光タグでマークされた状態で細胞膜に送られてリサイクルされるか、赤色の蛍光タグでマークされた状態でリソソームに送られて分解されるかのいずれかである。^[1]

医薬品開発において融合タンパク質を作成する目的は、それぞれの「親」タンパク質の特性を、結果として得られるキメラタンパク質に伝えることです。現在、いくつかのキメラタンパク質医薬品が医療用に利用可能です。

多くのキメラタンパク質医薬品はモノクローナル抗体であり、その標的分子に対する特異性はマウスを使用して開発されたため、当初は「マウス」抗体でした。非ヒトタンパク質であるマウス抗体は、ヒトに投与されると免疫反応を引き起こす傾向があります。キメラ化プロセスでは、抗体分子のセグメントを置き換えてヒト抗体と区別します。たとえば、ヒト定常ドメインを導入すると、意図した治療標的に対する特異性を変えることなく、薬剤の免疫原性がある可能性のある部分のほとんどを排除できます。抗体の命名法では、このタイプの変更を、一般名に-xi- を挿入して示します(例: abci- xi -mab )。可変ドメインの一部もヒト部分に置き換えられると、ヒト化抗体が得られます。概念的にはキメラと区別できませんが、このタイプはdacli- zu -mabのように-zu- を使用して示されます。その他の例については、 モノクローナル抗体の一覧を参照してください。

キメラ抗体やヒト化抗体に加えて、キメラ構造を作成するための他の医薬品目的もあります。たとえば、エタネルセプトは、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）と免疫グロブリンG 1 Fcセグメントの組み合わせによって作成されたTNFαブロッカーです。TNFRは薬物標的に対する特異性を提供し、抗体のFcセグメントは薬物の安定性と送達性を高めると考えられています。^[2]治療用途に使用される追加のキメラタンパク質は次のとおりです。

• アフリベルセプト：オキサリプラチン耐性転移性大腸癌、新生血管性黄斑変性症、黄斑浮腫の治療に役立つヒト組換えタンパク質。^[2]
• リロナセプト： IL-1受容体の活性化を防ぐことで炎症を軽減し、クリオピリン関連周期性症候群（CAPS）を治療します。^[2]
• アレファセプト：エフェクターメモリーT細胞を選択的に標的としてT細胞応答を制御し、尋常性乾癬を治療する。^[2]
• ロミプロスチム：免疫血小板減少症を治療するペプチボディ。^[2]
• アバタセプト/ベラタセプト：T細胞の共刺激を阻害し、関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬などの自己免疫疾患を治療します。^[2]
• デニロイキン-ジフチトックス：皮膚リンパ腫を治療する。^[2]

組み換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子工学によって作成されたタンパク質です。これは通常、最初のタンパク質をコードするcDNA配列から終止コドンを除去し、次にライゲーションまたはオーバーラップ拡張 PCRによって2 番目のタンパク質の cDNA 配列をフレーム内に付加します。その後、その DNA 配列は細胞によって単一のタンパク質として発現されます。タンパク質は、元のタンパク質の両方の完全な配列、またはどちらかの一部のみを含むように設計できます。

2 つの実体がタンパク質である場合、リンカー (または「スペーサー」) ペプチドも追加されることが多く、これにより、タンパク質が独立して折り畳まれ、期待どおりに動作する可能性が高くなります。特に、リンカーがタンパク質の精製を可能にする場合、タンパク質またはペプチド融合体のリンカーには、2 つの別々のタンパク質の解放を可能にするプロテアーゼまたは化学薬品の切断部位が組み込まれることがあります。この技術は、ニッケルまたはコバルト樹脂を使用したアフィニティークロマトグラフィーを使用して単離できるGST タンパク質、FLAG ペプチド、またはヘキサヒスチジン ペプチド(6xHis タグ)を融合することにより、タンパク質の識別と精製によく使用されます。人工的なタンパク質の二量体化または多量体化を誘導するペプチド ドメイン (例:ストレプトアビジンまたはロイシン ジッパー)を元のタンパク質に融合することにより、遺伝子工学によって二量体または多量体のキメラ タンパク質を製造することができます。融合タンパク質は、疾患の発症を研究するために、毒素または抗体を結合させて製造することもできます。ヒドロゲナーゼプロモーターP _SHは、緑色蛍光タンパク質（gfp）レポーター遺伝子を使用してP _SHプロモーター-gfp融合体を構築することで研究されました。^[3]

新しい組み換え技術により、バイオ検出、製紙・食品産業、バイオ医薬品など、さまざまな分野での使用に向けた融合タンパク質の設計を改良することが可能になった。最近の改良には、N末端やC末端などの既存のタンパク質の領域に単一のペプチドまたはタンパク質断片を融合することが含まれており、以下の特性が向上することが知られている。^[4]

• 触媒効率：特定のペプチドの融合により、標的タンパク質の三次構造と四次構造が変化し、触媒効率が向上します。 ^[4]
• 溶解性：融合タンパク質の設計における一般的な課題は、新しく合成された融合タンパク質が組み換え宿主内で不溶性となり、細胞内で標的タンパク質が過剰に凝集してしまうことです。タンパク質の折り畳みを助ける分子シャペロンを追加することで、溶質中の疎水性相互作用と親水性相互作用をより適切に分離し、タンパク質の溶解性を高めることができます。^[4]
• 熱安定性：標的タンパク質のN末端またはC末端の柔軟性を低下させるために、通常、単一のペプチドまたはタンパク質断片が添加され、これにより熱安定性が強化され、pH範囲が安定化されます。^[4]
• 酵素活性：水素結合の導入を伴う融合は、全体的な酵素活性を拡大するために使用できる可能性がある。^[4]
• 発現レベル：マルトース結合タンパク質（MBP）や小さなユビキチン様分子（SUMO ）などの多数の融合フラグメントの添加は、酵素発現と標的タンパク質の分泌を増強するのに役立つ。^[4]
• 固定化：PHA合成酵素は、目的のタンパク質の固定化を可能にする酵素であり、産業研究において重要な融合タグである。^[4]
• 結晶の品質：タンパク質間に共有結合を追加することで結晶の品質が向上し、構造決定技術に役立ちます。^[4]

組み換えタンパク質設計の最も初期の応用は、アフィニティークロマトグラフィーにおけるタンパク質の精製に単一ペプチドタグを使用したことに遡ります。それ以来、蛍光タンパク質タグから組み換え融合タンパク質医薬品まで、さまざまな融合タンパク質設計技術が開発されてきました。一般的に使用される3つの設計技術には、タンデム融合、ドメイン挿入、翻訳後結合があります。^[5]

目的のタンパク質は、タンパク質間のN末端またはC末端の融合を介して端から端まで単純に結合されます。これにより、適切な折り畳みを確実にするために融合パートナー間に十分なスペースを可能にする柔軟なブリッジ構造が得られます。しかし、ペプチドのN末端またはC末端は、組み換えタンパク質の望ましい折り畳みパターンを得るための重要な構成要素であることが多く、この場合、ドメインの単純な端から端までの結合は効果的ではありません。このため、目的のタンパク質ドメインの機能を維持するために、タンパク質リンカーが必要になることがよくあります。^[5]

この技術は、望ましい構造を単一のポリペプチド鎖にコード化することにより、連続したタンパク質ドメインを融合するものであるが、場合によっては、別のドメイン内にドメインを挿入する必要がある。この技術は、目的の遺伝子内で適切なライゲーション部位を見つけるのが難しいため、通常、タンデム融合よりも実行が難しいと考えられている。^[5]

この技術は、他の組み換え技術で使用される翻訳前の遺伝子融合とは対照的に、目的のタンパク質のリボソーム翻訳後にタンパク質ドメインを融合します。 ^[5]

タンパク質リンカーは、ドメイン間に適切な間隔を提供することで融合タンパク質の設計を助け、N末端またはC末端の相互作用が折り畳みに重要である場合に正しいタンパク質の折り畳みをサポートします。一般的に、タンパク質リンカーは重要なドメインの相互作用を可能にし、安定性を強化し、立体障害を軽減するため、N末端とC末端が融合できる場合でも融合タンパク質の設計に使用するのが好まれます。リンカーには、フレキシブル、リジッド、生体内切断可能な3つの主要なタイプがあります。^{[5] [6]}

• 柔軟なリンカーは多くの小さなグリシン残基で構成されており、動的で適応性のある形状にカールする能力を持っています。^[6]
• 剛性リンカーは大きな環状プロリン残基から形成され、ドメイン間の非常に特異的な間隔を維持する必要がある場合に役立ちます。^[6]
• 生体内で切断可能なリンカーは、特定のpH勾配などの特定の反応条件下で、または細胞内の別の生体分子と接触したときに、1つまたは複数の融合ドメインを放出できるように設計されているという点で独特です^{。 [6]}

自然に発生する融合遺伝子は、染色体転座によって1 つの遺伝子の末端エクソンが 2 番目の遺伝子の完全なエクソンに置き換えられるときに最もよく生成されます。これにより、転写、スプライシング、翻訳されて機能的な融合タンパク質を生成できる単一の遺伝子が作成されます。多くの重要な癌促進性オンコゲンは、このようにして生成された融合遺伝子です。

例:

• Gag-onc融合タンパク質
• Bcr-abl融合タンパク質
• Tpr-met融合タンパク質

抗体はV(D)J組み換えによって生成される融合タンパク質です。

また、2つの明確に定義されたモジュールが融合したように見える天然ポリペプチドの稀な例もあり、各モジュールは他方から独立して特徴的な活性または機能を発揮します。2つの主な例としては、各PP2Cモジュールがタンパク質ホスファターゼ2C酵素活性を示す、熱帯マラリア原虫Plasmodium falciparum^{の二重PP2Cキメラ[7]}と、多数の単細胞生物（原生動物寄生虫やフラボバクテリアなど）に存在し、全長シクロフィリンとFKBPシャペロンモジュールを含む二重ファミリーの免疫フィリン^{[8] [9]}があります。このようなキメラの進化的起源は不明のままです。

• 遺伝子工学
• タンパク質工学
• 細胞間融合因子

• 米国国立医学図書館の医学主題標目表(MeSH)における変異体 + キメラ + タンパク質
• ChiPPI Archived 2021-11-10 at the Wayback Machine : キメラタンパク質のサーバータンパク質間相互作用。