人工遺伝子合成

人工遺伝子合成、または単に遺伝子合成は、合成生物学でヌクレオチドから遺伝子を新たに構築および組み立てるために使用される一連の方法を指します。生きた細胞におけるDNA合成とは異なり、人工遺伝子合成ではテンプレートDNAを必要とせず、事実上あらゆるDNA配列を研究室で合成することができます。人工遺伝子合成は2つの主なステップで構成され、最初のステップは固相DNA合成で、 DNAプリンティングとも呼ばれます。^[1]これにより、通常200塩基対未満のオリゴヌクレオチド断片が生成されます。次に、2番目のステップでは、さまざまなDNA組み立て方法を使用してこれらのオリゴヌクレオチド断片を結合します。人工遺伝子合成ではテンプレートDNAが必要ないため、ヌクレオチド配列やサイズに制限のない完全に合成されたDNA分子を作成することが理論的に可能です。

最初の完全な遺伝子である酵母tRNAの合成は、1972年にハル・ゴビンド・コラナと同僚によって実証されました。 ^[2]最初のペプチドおよびタンパク質コード遺伝子の合成は、それぞれハーバート・ボイヤーとアレクサンダー・マーカムの研究室で行われました。 ^{[3] [4]}最近では、染色体全体とゲノムの組み立てを可能にする人工遺伝子合成法が開発されました。最初の合成酵母染色体は2014年に合成され、機能的な細菌染色体全体も合成されました。^{[5]さらに、将来的には人工遺伝子合成で新しい}核酸塩基対（非天然塩基対）を利用できるようになるかもしれません。^{[6] [7] [8]}

オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドホスホラミダイトと呼ばれる構成要素を使用して化学的に合成されます。これらは、アミン、ヒドロキシル基、リン酸基が誤って相互作用するのを防ぐ保護基を持つ通常のヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドです。1 度に 1 つのホスホラミダイトが追加され、5' ヒドロキシル基が脱保護され、新しい塩基が追加されるなどします。鎖は 3' から 5' の方向に成長します。これは生合成に対して逆方向です。最後に、すべての保護基が除去されます。ただし、化学プロセスであるため、いくつかの誤った相互作用が発生し、一部の欠陥のある製品につながります。合成されるオリゴヌクレオチド配列が長いほど、欠陥が多くなるため、このプロセスは短いヌクレオチド配列を生成する場合にのみ実用的です。現在の実用的な制限は、生物学的用途に直接使用するのに十分な品質のオリゴヌクレオチドの場合、約 200 bp (塩基対) です。HPLCを使用して、適切な配列の製品を分離できます。一方、遺伝子チップ上では多数のオリゴを並行して合成することができます。その後の遺伝子合成手順で最適なパフォーマンスを得るには、オリゴを個別に、より大規模に準備する必要があります。

通常、個別に設計されたオリゴヌクレオチドのセットは、自動固相合成装置で作成され、精製され、その後、特異的なアニーリングおよび標準的なライゲーションまたはポリメラーゼ反応によって接続されます。オリゴヌクレオチドのアニーリングの特異性を向上させるために、合成ステップでは、熱安定性DNAリガーゼとポリメラーゼ 酵素のセットに依存しています。現在までに、リン酸化オーバーラップオリゴヌクレオチドのライゲーション、^{[2] [3]} Fok I法^[4]および遺伝子合成のためのリガーゼ連鎖反応の修正形式など、いくつかの遺伝子合成方法が記載されています。さらに、いくつかのPCRアセンブリアプローチが記載されています。^[9]通常、それらは互いにオーバーラップする40〜50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用します。これらのオリゴヌクレオチドは、両方の鎖の配列の大部分をカバーするように設計されており、完全長分子は、オーバーラップエクステンション（OE）PCR、^[9]、熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト（TBIO）PCR ^[10]、または組み合わせたアプローチによって段階的に生成されます。^[11]最も一般的に合成された遺伝子のサイズは600〜1,200 bpですが、以前に組み立てられた1,000 bp未満の断片を接続することで、はるかに長い遺伝子が作成されています。 このサイズ範囲では、自動シーケンシング方法でクローン化された合成遺伝子の配列を確認するために、いくつかの候補クローンをテストする必要があります。

さらに、全長遺伝子産物の組み立ては、長い一本鎖オリゴヌクレオチドの効率的で特異的なアラインメントに依存するため、合成成功の重要なパラメータには、逆方向反復、異常に高いまたは低い GC 含有量、または反復構造によって生じる二次構造を含む拡張配列領域が含まれます。通常、特定の遺伝子のこれらのセグメントは、手順をいくつかの連続したステップに分割し、最後に短いサブシーケンスを組み立てることによってのみ合成できますが、その結果、その生成に必要な時間と労力が大幅に増加します。遺伝子合成実験の結果は、使用するオリゴヌクレオチドの品質に大きく依存します。これらのアニーリングベースの遺伝子合成プロトコルの場合、製品の品質は、使用するオリゴヌクレオチドの正確さに直接的かつ指数関数的に依存します。または、品質の低いオリゴで遺伝子合成を実行した後は、クローン分析中に下流の品質保証にさらに労力を費やす必要があります。これは通常、時間のかかる標準的なクローニングおよびシーケンシング手順によって行われます。現在のすべての遺伝子合成法に関連するもう 1 つの問題は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの使用による、配列エラーの頻度が高いことです。エラー頻度はオリゴヌクレオチドが長くなるにつれて増加し、結果として、オリゴヌクレオチドの使用量が増えるにつれて、正しい生成物の割合が劇的に減少します。突然変異の問題は、遺伝子の組み立てに使用するオリゴヌクレオチドを短くすることで解決できます。ただし、アニーリング ベースのすべての組み立て法では、プライマーを 1 つのチューブで混合する必要があります。この場合、オーバーラップが短いと、相補プライマーの正確で特定のアニーリングが常に可能になるわけではなく、完全長の生成物の形成が阻害されます。オリゴヌクレオチドの手動設計は手間のかかる手順であり、目的の遺伝子の合成が成功することを保証するものではありません。ほぼすべてのアニーリング ベースの方法の最適なパフォーマンスを得るには、オーバーラップ領域の融解温度がすべてのオリゴヌクレオチドで同じである必要があります。必要なプライマーの最適化は、専用のオリゴヌクレオチド設計プログラムを使用して実行する必要があります。これまでに、遺伝子合成用のプライマー設計を自動化するためのいくつかのソリューションが提示されています。^{[12] [13] [14]}

オリゴヌクレオチドの品質に関連する問題を克服するために、別々に調製されたフィッシングオリゴヌクレオチド^{[15] 、} mutSファミリーのミスマッチ結合酵素^[16]、または細菌またはファージ由来の特定のエンドヌクレアーゼ^[17]を使用するいくつかの精巧な戦略が開発されました。しかし、これらの戦略はすべて、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドのアニーリングに基づく遺伝子合成の時間とコストを増加させます。

大規模並列シーケンシングは、複雑なオリゴヌクレオチドライブラリをスクリーニングし、正確な分子の取得を可能にするツールとしても使用されています。1つのアプローチでは、オリゴヌクレオチドは454パイロシーケンシングプラットフォームでシーケンスされ、ロボットシステムが正確なシーケンスに対応する個々のビーズをイメージングして選択します。^[18]別のアプローチでは、複雑なオリゴヌクレオチドライブラリは、大規模並列シーケンシングの前に固有のフランキングタグで変更されます。その後、タグ指向プライマーにより、ダイヤルアウトPCRによって目的のシーケンスを持つ分子を取得できます。^[19]

遺伝子は、機能的に関連する遺伝子や、単一の遺伝子の複数の配列変異体を含むセットで並べられることが多くなっています。モノクローナル抗体など、開発中の治療用タンパク質のほぼすべては、機能や発現の改善のために多くの遺伝子変異体をテストすることで最適化されています。

従来の核酸合成では、アデニン、チミン、グアニン、シトシンの 4 つの塩基対のみが使用されますが、将来のオリゴヌクレオチド合成では、自然界には存在しない人工的に設計および合成された核酸塩基である非天然塩基対の使用が組み込まれる可能性があります。

2012年、カリフォルニア州サンディエゴのスクリプス研究所の化学生物学者フロイド・ロムスバーグ率いるアメリカの科学者グループが、彼のチームが人工塩基対（UBP）を設計したことを発表しました。2つの新しい人工ヌクレオチド、すなわち人工塩基対（UBP）は、 d5SICSとdNaMと名付けられました。より技術的には、疎水性核酸塩基を持つこれらの人工ヌクレオチドは、DNA内で（d5SICS-dNaM）複合体または塩基対を形成する2つの融合芳香族環を特徴としています。2014年、スクリプス研究所の同じチームが、天然のTA塩基対とCG塩基対を含むプラスミドと呼ばれる環状DNAの断片を、ロムスバーグの研究室が設計した最も高性能なUBPとともに合成し、一般的な細菌である大腸菌の細胞に挿入したところ、複数世代にわたって人工塩基対を複製することに成功したと報告しました。これは、生物が拡張された遺伝コードを次の世代に受け継いだ最初の既知の例です。これは、 d5SICSTP と dNaMTP の両方の三リン酸を大腸菌に効率的に取り込むヌクレオチド三リン酸トランスポーターを発現する藻類の補助遺伝子を追加することで部分的に達成されました。その後、細菌の自然な複製経路がそれらを使用して、d5SICS-dNaM を含む プラスミドを正確に複製します。

3番目の塩基対の組み込みに成功したことは、DNAでコード化できるアミノ酸の数を現在の20アミノ酸から理論的には172アミノ酸にまで大幅に増やすという目標に向けた大きな進歩であり、それによって生物が新しいタンパク質を生産する可能性が拡大する。^[20]将来的には、これらの非天然塩基対を合成し、DNA印刷法によってオリゴヌクレオチドに組み込むことができるようになるかもしれない。

したがって、 DNAプリンティングは、特定の生物学的機能をコードするDNA配列（プロモーター、転写調節配列、オープンリーディングフレームなど）として定義されるDNAパーツの製造に使用できます。^[21]しかし、オリゴヌクレオチド合成では通常、数百塩基対を超えるオリゴヌクレオチド配列を正確に生成できないため、DNAアセンブリ法を使用してこれらのパーツを組み立て、機能的な遺伝子、複数遺伝子回路、さらには合成染色体やゲノム全体を作成する必要があります。 DNAアセンブリ技術の中には、DNAパーツを結合するためのプロトコルのみを定義するものもあれば、それらと互換性のあるDNAパーツの形式のルールも定義するものもあります。 これらのプロセスを拡大すると、染色体全体またはゲノム全体のアセンブリが可能になります。 近年、さまざまなDNAアセンブリ標準の数が急増しており、2015年の時点で14の異なるアセンブリ標準が開発されており、それぞれに長所と短所があります。 [ ^22] 全体として、DNAアセンブリ標準の開発は、合成生物学のワークフローを大幅に促進し、研究グループ間の材料の交換を助け、またモジュール式で再利用可能なDNAパーツの作成を可能にしました。^[22]

さまざまなDNAアセンブリ方法は、エンドヌクレアーゼを介したアセンブリ、部位特異的組換え、および長いオーバーラップに基づくアセンブリの3つの主要なカテゴリに分類できます。^[22]各方法グループには、独自の特徴と独自の利点と限界があります。

エンドヌクレアーゼは核酸セグメントを認識して切断する酵素であり、DNA アセンブリを指示するために使用できます。さまざまな種類の制限酵素のうち、II 型制限酵素は、切断部位が認識部位の近くまたは認識部位内にあるため、最も一般的に利用され使用されています。したがって、エンドヌクレアーゼを介したアセンブリ方法では、この特性を利用して DNA パーツとアセンブリ プロトコルを定義します。

BioBricksアセンブリ標準は、2003年にトム・ナイトによって説明され、導入され、それ以来継続的に更新されてきました。^[23]現在、最も一般的に使用されているBioBricks標準は、アセンブリ標準10、またはBBF RFC 10です。BioBricksは、DNAパーツがBioBricksアセンブリ方法と互換性を持つために必要なプレフィックスとサフィックスのシーケンスを定義し、BioBricks形式のすべてのDNAパーツを結合できるようにします。

プレフィックスには EcoRI、NotI、XBaI の制限部位が含まれ、サフィックスには SpeI、NotI、PstI の制限部位が含まれます。プレフィックスとサフィックスの領域以外では、DNA 部分にこれらの制限部位を含めることはできません。2 つの BioBrick 部分を結合するには、プラスミドの 1 つを EcoRI と SpeI で消化し、もう 1 つのプラスミドを EcoRI と XbaI で消化します。2 つの EcoRI オーバーハングは相補的であるため、一緒にアニールされますが、SpeI と XbaI も相補的なオーバーハングを生成し、これも一緒にライゲーションできます。結果として得られるプラスミドには元のプレフィックスとサフィックスの配列が含まれるため、より多くの BioBrick 部分と結合するために使用できます。^{[24]この特性のため、BioBrick アセンブリ標準は本質的に}冪等性があると言われています。ただし、2 つの融合された BioBrick の間には「傷跡」配列 (TACTAG または TACTAGAG) も形成されます。これにより、バイオブリックは融合タンパク質の作成に使用できなくなります。6bpの瘢痕配列はチロシンと終止コドンをコードし、最初のドメインが発現した後に翻訳が終了し、8bpの瘢痕配列はフレームシフトを引き起こし、コドンの連続的な読み取りを妨げます。たとえば、6bpの瘢痕を与える代替の瘢痕配列、または終止コドンを含まない瘢痕配列を提供するために、BB-2アセンブリ、BglBricksアセンブリ、シルバーアセンブリ、フライブルクアセンブリなどの他のアセンブリ標準が設計されました。^{[25] [26] [27] [28]}

バイオブリック部品を組み立てる最も簡単な方法は上で説明しましたが、標準的な組み立て方法よりもいくつかの利点がある、他の一般的な組み立て方法もいくつかあります。3抗生物質（3A）組み立てでは、抗生物質の選択によって正しい組み立てが選択されますが、増幅インサート組み立てでは、3A組み立てで見られる低い形質転換効率を克服しようとします。^{[29] [30]}

BioBrickアセンブリ標準は、DNAアセンブリに他のタイプのエンドヌクレアーゼを使用する際のインスピレーションにもなりました。たとえば、iBrick標準とHomeRunベクターアセンブリ標準はどちらも、タイプII制限酵素の代わりにホーミングエンドヌクレアーゼを使用しています。^{[31] [32]}

一部のアセンブリ方法では、タイプ IIs 制限エンドヌクレアーゼも使用されます。これらは、認識部位から数塩基対を切断する点で、他のタイプ II エンドヌクレアーゼとは異なります。その結果、オーバーハング配列を変更して、目的の配列を含めることができます。これにより、タイプ IIs アセンブリ方法には 2 つの利点があります。つまり、「傷のない」アセンブリが可能になり、ワンポットのマルチパート アセンブリが可能になります。タイプ IIs エンドヌクレアーゼを使用するアセンブリ方法には、Golden Gateとその関連バリアントが含まれます。

ゴールデンゲートアセンブリプロトコルは、エングラーらによって2008年に定義され、元の制限部位を欠きながらも、傷跡配列のない最終構造を与えるDNAアセンブリ方法を定義しました。これにより、タンパク質の折り畳みや発現に悪影響を与える可能性のある不要なタンパク質配列を含めずにタンパク質を発現できます。4塩基対のオーバーハングを生成するBsaI制限酵素を使用することで、最大240のユニークな非回文配列をアセンブリに使用できます。^[33]

プラスミドの設計と組み立て

ゴールデンゲートクローニングでは、組み立てられる各 DNA 断片は、プログラムされたオーバーハング配列を含む内側を向いた BsaI 制限部位に挟まれたプラスミド内に置かれます。各 DNA 断片の 3' オーバーハング配列は、次の下流 DNA 断片の 5' オーバーハングと相補的です。最初の断片の 5' オーバーハングは、目的のプラスミドの 5' オーバーハングと相補的であり、最後の断片の 3' オーバーハングは、目的のプラスミドの 3' オーバーハングと相補的です。このような設計により、すべての DNA 断片をワンポット反応 (すべての反応物を一緒に混合する) で組み立てることができ、すべての断片が正しい配列に配置されます。組み立てに成功したコンストラクトは、元々目的のプラスミドにあったスクリーニングカセットの機能喪失を検出することによって選択されます。^[33]

MoCloとGolden Braid

オリジナルのゴールデンゲートアセンブリでは、デスティネーションベクターで作成できるコンストラクトは1つだけです。このコンストラクトを後続の反応でエントリーベクターとして使用できるようにするために、MoCloとゴールデンブレイドの標準が設計されました。^[34]

MoClo 標準では、DNA アセンブリの複数の層を定義します。

• MoClo および Golden Braid アセンブリ標準は、オリジナルの Golden Gate アセンブリ標準から派生したものです。
  ティア 1: ティア 1 アセンブリは標準的な Golden Gate アセンブリであり、遺伝子はコンポーネント部分 ( UTR、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター配列などの遺伝要素をコードする DNA 部分) から組み立てられます。ティア 1 デスティネーション ベクターの挿入部位の両側には、内側に切断する BpiI 制限部位のペアがあります。これにより、これらのプラスミドをティア 2 デスティネーション ベクターのエントリ ベクターとして使用できます。
• ティア 2: ティア 2 アセンブリでは、ティア 1 アセンブリで組み立てられた遺伝子をさらに組み立てて、複数の遺伝子コンストラクトを作成します。さらに上位のティア アセンブリが必要な場合は、挿入部位の両側に内側に切断する BsaI 制限部位を追加できます。これらのベクターは、上位のティア コンストラクトのエントリ ベクターとして使用できます。

各アセンブリ層では、BsaI および BpiI 制限部位を交互に使用して禁止部位の数を最小限に抑え、各層の連続アセンブリは Golden Gate プラスミド設計に従って実現されます。全体として、MoClo 標準では、一連のワンポット Golden Gate 反応によって、すべて異なる DNA 部分から組み立てられた複数の転写ユニットを含むコンストラクトのアセンブリが可能です。ただし、MoClo 標準の欠点の 1 つは、最終的なコンストラクトに必要な構成パーツが 4 つ未満の場合、生物学的機能のない「ダミーパーツ」を使用する必要があることです。^[35]一方、Golden Braid 標準では、ペアワイズ Golden Gate アセンブリ標準が導入されました。

Golden Braid 標準は MoClo と同じ階層型アセンブリを使用しますが、各階層では 2 つの DNA フラグメントのアセンブリのみを行います (ペアワイズ アプローチ)。したがって、各階層では、遺伝子のペアが目的のシーケンスで目的のフラグメントにクローン化され、その後、次の階層で 2 つずつアセンブリされます。MoClo と同様に、Golden Braid 標準は各階層間で BsaI 制限酵素と BpiI 制限酵素を交互に使用します。

ゴールデンゲートアセンブリ法とその変種の発展により、研究者は合成生物学のワークフローを高速化するためのツールキットを設計できるようになりました。たとえば、EcoFlexはDNAパーツにMoClo標準を使用する大腸菌用のツールキットとして開発されましたが、同様のツールキットはクラミドモナス・ラインハルティ微細藻類のエンジニアリングにも開発されました。^{[36] [37]}

部位特異的組換えでは、制限酵素の代わりにファージインテグラーゼを使用するため、DNA断片に制限部位を設ける必要がなくなります。代わりに、インテグラーゼは固有のアタッチメント（att）部位を使用し、標的断片と目的ベクター間のDNA再配置を触媒します。Invitrogen Gatewayクローニングシステムは1990年代後半に発明され、BPクロナーゼとLRクロナーゼという2つの独自の酵素混合物を使用しています。BPクロナーゼミックスは、attB部位とattP部位間の組換えを触媒し、ハイブリッドattL部位とattR部位を生成します。一方、LRクロナーゼミックスは、attL部位とattR部位の組換えを触媒し、attB部位とattP部位を生成します。各酵素ミックスは特定のatt部位のみを認識するため、組換えは非常に特異的であり、断片は目的の配列で組み立てられます。^[38]

ベクター設計とアセンブリ

Gateway クローニングは独自の技術であるため、すべての Gateway 反応は製造元が提供する Gateway キットを使用して実行する必要があります。反応は 2 つのステップにまとめることができます。最初のステップでは、対象の DNA フラグメントを含むエントリー クローンを組み立て、2 番目のステップでは、対象のこのフラグメントを目的のクローンに挿入します。

1. エントリー クローンは、attP 部位に挟まれた Gateway カセットを含む、付属の「ドナー」ベクターを使用して作成する必要があります。Gateway カセットには、正常に組み換えられたエントリー クローンの生存と選択を可能にする細菌自殺遺伝子(例: ccdB ) が含まれています。対象の DNA フラグメントの両側に 1 組の attB サイトが追加され、BP クロナーゼ ミックスが追加されると、attP サイトとの組み換えが可能になります。エントリー クローンが生成され、対象のフラグメントの両側に attL サイトが配置されます。
2. デスティネーション ベクターにも Gateway カセットが付属していますが、その代わりに 1 組の attR サイトが両側にあります。このデスティネーション プラスミドをエントリー クローンおよび LR クロナーゼ ミックスと混合すると、attR サイトと attL サイトの間で組み換えが起こります。目的のフラグメントが挿入されたデスティネーション クローンが生成されます。致死遺伝子が元のベクターに挿入され、このプラスミドで形質転換された細菌は死滅します。したがって、目的のベクターを簡単に選択できます。

ゲートウェイクローニング法の初期の反復では、生成された各デスティネーションクローンに対して使用できるエントリークローンは1つだけであった。しかし、さらなる研究により、さらに4つの直交配列を生成できることが明らかになり、最大4つの異なるDNA断片の組み立てが可能となり、このプロセスは現在マルチサイトゲートウェイ技術として知られている。^[39]

ゲートウェイクローニング以外にも、他のインテグラーゼを使用した非商用の方法も開発されている。例えば、セリンインテグラーゼ組換えアセンブリ（SIRA）法ではϕC31インテグラーゼを使用し、部位特異的組換えタンデムアセンブリ（SSRTA）法ではストレプトマイセスファージφBT1インテグラーゼを使用する。^{[40] [41]}ホームランベクターアセンブリシステム（HVAS）などの他の方法は、ゲートウェイクローニングシステムに基づいて構築され、さらにホーミングエンドヌクレアーゼを組み込んで、合成DNA構造の工業的合成をサポートする可能性のあるプロトコルを設計している。^[31]

近年、さまざまなロングオーバーラップベースのアセンブリ方法が開発されています。最も一般的に使用されている方法の1つであるギブソンアセンブリ方法は2009年に開発され、制限酵素やインテグラーゼの使用を必要としないワンポットDNAアセンブリ方法を提供します。^[42]その他の同様のオーバーラップベースのアセンブリ方法には、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（CPEC）、配列およびリガーゼ非依存クローニング（SLIC）、シームレスライゲーションクローニング抽出（SLiCE）などがあります。^{[43] [44] [45]}多くのオーバーラップアセンブリ方法が存在するにもかかわらず、ギブソンアセンブリ方法はまだ最も人気があります。^[46]上記の方法に加えて、他の研究者はギブソンアセンブリやその他のアセンブリ方法で使用されている概念に基づいて、リンカーを使用したモジュラーオーバーラップ指向アセンブリ（MODAL）戦略や、等倍クローニングのためのバイオパーツアセンブリ標準（BASIC）方法などの新しいアセンブリ戦略を開発しました。^{[47] [48]}

ギブソンアセンブリ法は、比較的簡単な DNA アセンブリ法であり、必要な追加試薬は 5' T5エキソヌクレアーゼ、Phusion DNA ポリメラーゼ、およびTaq DNA リガーゼのみです。アセンブリする DNA フラグメントは、アセンブリする順序で 5' 末端と 3' 末端が重なるように合成されます。これらの試薬は、アセンブリする DNA フラグメントと 50 °C で混合され、次の反応が起こります。

1. T5 エキソヌクレアーゼは各断片の 5' 末端から DNA を分解し、各 DNA 断片の 3' オーバーハングを露出させます。
2. 隣接する DNA 断片上の相補的なオーバーハングは、相補的な塩基対形成によってアニールします。
3. Phusion DNA ポリメラーゼは、断片がアニールするギャップを埋めます。
4. Taq DNA リガーゼは両方の DNA 鎖の切断を修復します。

T5エキソヌクレアーゼは熱に不安定であるため、最初のチューバックステップの後、50℃で不活性化されます。したがって、生成物は安定しており、フラグメントは目的の順序で組み立てられます。このワンポットプロトコルは、最大5つの異なるフラグメントを正確に組み立てることができますが、いくつかの商業プロバイダーは、2段階の反応で最大15の異なるフラグメントを正確に組み立てるキットを提供しています。^[49]しかし、ギブソンアセンブリプロトコルは高速で、比較的少ない試薬を使用する一方で、各フラグメントは隣接するフラグメントと重複する配列を含むように設計し、PCRで増幅する必要があるため、特注のDNA合成が必要です。PCRへの依存は、長いフラグメント、GC含有量の高いフラグメント、または繰り返し配列が使用される場合に、反応の忠実度にも影響を与える可能性があります。^[48]

MODAL 戦略では、「リンカー」と呼ばれるオーバーラップ シーケンスを定義して、各 DNA フラグメントで行う必要のあるカスタマイズの量を減らします。リンカーは R2oDNA Designer ソフトウェアを使用して設計され、オーバーラップ領域はギブソン アセンブリおよびその他のオーバーラップ アセンブリ方法と互換性があるように 45 bp の長さに設計されました。これらのリンカーを組み立てるパーツに取り付けるには、15 bp のプレフィックスとサフィックスのアダプター シーケンスを含むパーツ固有のプライマーを使用して PCR を実行します。次に、2 回目の PCR 反応によってリンカーをアダプター シーケンスに取り付けます。DNA フラグメントを配置するには、同じリンカーを目的の上流フラグメントのサフィックスと目的の下流フラグメントのプレフィックスに取り付けます。リンカーを取り付けたら、ギブソン アセンブリ、CPEC、またはその他のオーバーラップ アセンブリ方法を使用して、DNA フラグメントを目的の順序で組み立てることができます。

BASICアセンブリ戦略は2015年に開発され、従来のアセンブリ技術の限界に対処することを目指し、標準的な再利用可能な部品、単層フォーマット（すべての部品が同じフォーマットで、同じプロセスを使用して組み立てられる）、べき等クローニング、並列（マルチパーツ）DNAアセンブリ、サイズ非依存性、自動化という6つの主要概念を取り入れました。^[48]

DNAパーツとリンカー設計

DNAパーツは設計され、ストレージプラスミドにクローニングされ、その両側には統合されたプレフィックス（i P ）と統合されたサフィックス（i S ）配列が配置されています。i P およびi S 配列には、BASICリンカーに相補的なオーバーハングを含む、内側を向いたBsaI制限部位が含まれています。^[48] MODALと同様に、BASICで使用される7つの標準リンカーは、R2oDNA Designerソフトウェアで設計され、シャーシゲノムと相同性のある配列が含まれないこと、および二次構造配列、制限部位、リボソーム結合部位などの不要な配列が含まれていないことを確認するためにスクリーニングされました。各リンカー配列は2つの半分に分割され、それぞれにBsaI制限部位に相補的な4 bpのオーバーハング、12 bpの二本鎖配列があり、もう半分と21 bpの重複配列を共有しています。上流の DNA 部分に結合する半分はサフィックス リンカー部分 (例: L1S) と呼ばれ、下流の部分に結合する半分はプレフィックス リンカー部分 (例: L1P) と呼ばれます。これらのリンカーは、DNA 部分を組み立てるための基礎を形成します。

アセンブリの順序を指示するだけでなく、標準 BASIC リンカーは他の機能を実行するように変更することもできます。べき等アセンブリを可能にするために、リンカーは、BsaI によって認識されないように保護するために、追加のメチル化されたi P およびi S 配列が挿入された状態で設計されました。このメチル化は、形質転換および in vivo プラスミド複製後に失われ、プラスミドは抽出、精製され、さらなる反応に使用できます。

リンカー配列は比較的長いため (標準リンカーの場合は 45bp)、機能的な DNA 配列を組み込んで、アセンブリ中に必要な DNA パーツの数を減らすことができます。BASIC アセンブリ標準では、異なる強度の RBS が組み込まれた複数のリンカーが提供されています。同様に、複数のタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の構築を容易にするために、DNA 構造の完全な読み取りを可能にする複数の融合リンカーも設計されています。これらの融合リンカーは、15 アミノ酸のグリシンとセリンのポリペプチドをコードしており、これは複数のドメインを持つ融合タンパク質に最適なリンカー ペプチドです。

組み立て

最終的な構造物の組み立てには、主に 3 つのステップがあります。

1. まず、DNA 部分がストレージプラスミドから切り出され、3' 末端と 5' 末端に BsaI オーバーハングを持つ DNA 断片が生成されます。
2. 次に、各リンカー部分は、T4 DNA リガーゼでインキュベートすることにより、それぞれの DNA 部分に取り付けられます。各 DNA 部分には、2 つの異なるリンカーからの接尾辞と接頭辞のリンカー部分があり、アセンブリの順序を指示します。たとえば、シーケンスの最初の部分には L1P と L2S が、2 番目の部分には L2P と L3S が取り付けられます。リンカー部分を変更して、アセンブリの順序を変更できます。
3. 最後に、リンカーが取り付けられたパーツは、50 °C でインキュベートすることでプラスミドに組み立てられます。P および S リンカーの 21 bp のオーバーハングがアニールされ、最終構造はクローニングのために細菌細胞に形質転換できます。一本鎖の切れ目は形質転換後に体内で修復され、プラスミドにクローニングされた安定した最終構造が生成されます。

DNAプリンティングとDNAアセンブリ法によって、過去数年にわたって商業的な遺伝子合成が徐々に指数関数的に安価になったため、^[50]人工遺伝子合成は、新しいDNA配列とタンパク質機能を作成および設計するための強力で柔軟なエンジニアリングツールとなります。合成生物学に加えて、異種遺伝子発現、ワクチン開発、遺伝子治療、分子工学などのさまざまな研究分野は、タンパク質やペプチドをコードするDNAを合成する迅速かつ安価な方法があれば大きな恩恵を受けるでしょう。^{[51] DNAプリンティングとアセンブリに使用される方法は、DNAを}情報記憶媒体として使用することを可能にしました。

2007年6月28日、 J・クレイグ・ベンター研究所の研究チームがサイエンス・エクスプレス誌に論文を発表し、マイコプラズマ・ミコイデス細菌の天然DNAをマイコプラズマ・カプリコルム細胞に移植し、マイコプラズマ・ミコイデスのような挙動を示す細菌を作り出すことに成功したと述べた。^[52]

2007年10月6日、クレイグ・ベンターはイギリスのガーディアン紙のインタビューで、同じチームがマイコプラズマ・ジェニタリウムの単一染色体の改変版を人工的に合成したと発表した。染色体は、生きた細菌でのテストで不要と判明したすべての遺伝子を除去するように改変された。この最小ゲノムプロジェクトの次の計画段階は、合成された最小ゲノムを古いDNAを取り除いた細菌細胞に移植することである。結果として得られる細菌はマイコプラズマ・ラボラトリアムと呼ばれる。翌日、カナダの生命倫理団体ETCグループは代表者のパット・ムーニーを通じて声明を発表し、ベンターの「創造物」は「ほとんど何でも作れるシャーシ」であると述べた。合成されたゲノムはまだ機能する細胞に移植されていなかった。^[53]

2010年5月21日、サイエンス誌は、ベンター研究グループがコンピューターの記録から細菌マイコプラズマ・ミコイデスのゲノムを合成し、DNAを除去したマイコプラズマ・カプリコルム細菌の既存の細胞に移植することに成功したと報じた。この「合成」細菌は生存可能、つまり数十億回複製する能力があった。研究チームは当初、以前から研究に取り組んでいたマイコプラズマ・ジェニタリウム細菌を使用する予定だったが、マイコプラズマ・ミコイデスの方が成長がはるかに速く、実験が迅速になるため、これに切り替えた。^[54]ベンターはこれを「親がコンピューターである最初の種」と表現している。^[55] ETCは、この形質転換された細菌を「シンシア」と名付けた。ベンターの広報担当者は、本稿執筆時点では、画期的な成果を認めていない。

合成酵母2.0プロジェクトの一環として、世界中の様々な研究グループが合成酵母ゲノムを合成し、このプロセスを通じてモデル生物であるサッカロミセス・セレビシエのゲノムを最適化するプロジェクトに参加しました。^[56]酵母2.0プロジェクトでは、上で説明したさまざまなDNAアセンブリ方法を適用し、2014年3月にニューヨーク大学ランゴーン医療センターのジェフ・ボークは、彼のチームがサッカロミセス・セレビシエの第3染色体を合成したことを明らかにしました。^{[57] [58]}この手順では、元の染色体の遺伝子を合成バージョンに置き換え、完成した合成染色体を酵母細胞に組み込みました。元の染色体の316,667対よりも少ない273,871塩基対のDNAを設計および作成する必要がありました。 2017年3月には16本の染色体のうち6本の合成が完了し、残りの染色体の合成はまだ進行中であった。^[59]

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