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多重アニーリングおよびループベース増幅サイクル（MALBAC）は、準線形全ゲノム増幅法です。非線形または指数関数的（各サイクルでコピーされたDNAが次のサイクルのテンプレートとして機能できる）な従来のDNA増幅法とは異なり、MALBACは、アンプリコンが相補的な末端を持ち、ループを形成することを可能にする特殊なプライマーを使用し、DNAが指数関数的にコピーされるのを防ぎます。これにより、元のゲノムDNAのみが増幅され、増幅バイアスが低減されます。MALBACは、「ゲノムの大部分をカバーするオーバーラップショットガンアンプリコンを作成するために使用されます」。[ 1 ]次世代シーケンシングでは、MALBACの後に通常のPCRが行われ、アンプリコンをさらに増幅します。
MALBACを行う前に、レーザーマイクロダイセクション、マイクロ流体デバイス、フローサイトメトリー、マイクロピペッティングなど様々な方法で単一細胞を分離し、溶解します。MALBACによる単一細胞全ゲノム増幅は、クエンチング、伸長、融解、ループ形成の5サイクルから構成されます。
MALBAC の主な利点は、DNA がほぼ直線的に増幅されることです。特殊なプライマーを使用することで、増幅産物がループ状になり、その後の MALBAC サイクルでそれ以上増幅されなくなります。これらのプライマーは 35 ヌクレオチド長で、テンプレートにハイブリダイズする 8 個の可変ヌクレオチドと 27 個の共通ヌクレオチドがあります。[ 1 ]共通ヌクレオチド配列は GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG です。8 個の可変ヌクレオチドは、一本鎖ゲノム DNA 分子にランダムにアニーリングします。1 回の伸長後、5' 末端のみに共通ヌクレオチド配列を含む増幅産物であるセミ増幅産物が作成されます。このセミ増幅産物は、別のラウンドの伸長のテンプレートとして使用され、その結果、3' 末端が 5' 末端の配列と相補的な増幅産物であるフル増幅産物が作成されます。
MALBACプライマーは可変成分を持ち、テンプレートDNAにランダムに結合することができます。つまり、どのサイクルでも、1つの断片に複数のプライマーがアニーリングする可能性があります。Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ（Bstポリメラーゼ）などのDNAポリメラーゼは、同じ方向に成長している上流の別の鎖の5'末端を置換することができます。[ 2 ]
Bst DNAポリメラーゼのエラー率は1/10000塩基である。[ 3 ]
PCRの最終段階では、ピコグラムの遺伝物質がマイクログラムのDNAに増幅され、配列決定に十分な量のDNAが得られる。
MALBACは、単一細胞からのDNA増幅に偏りのないアプローチを提供します。この単一細胞シーケンス法は、膨大な数のアプリケーションがあり、その多くはまだ活用されていません。MALBACは、法医学的試料の分析、遺伝性疾患の出生前スクリーニング、生殖細胞の発達の理解、または腫瘍の複雑さの解明に役立つ可能性があります。[ 1 ] [ 4 ]この技術の根幹は、研究者が単一細胞内で突然変異が蓄積する頻度を観察できるようにすることです。[ 1 ]さらに、細胞内および細胞間の染色体異常と遺伝子コピー数変異（CNV）の検出を可能にし、さらに一塩基多型（SNP）を引き起こすまれな突然変異の検出を容易にします。[ 1 ]
がん研究の分野では、MALBAC には多くの用途があります。腫瘍内異質性を調べたり、攻撃的または転移性の表現型をもたらす可能性のある遺伝子を特定したり、腫瘍が薬剤耐性を獲得する可能性を評価したりするために使用できます。[ 4 ] [ 5 ] MALBAC の先駆的な応用例は、2012 年 12 月号の Science に掲載され、この技術を使用して結腸がん細胞株 SW4802 の突然変異率を測定したことが説明されています。 [ 1 ] 3 つの近親結腸がん細胞の増幅 DNA を、異なる系統の無関係な結腸がん細胞と並行してシーケンスすることにより、偽陽性が検出されずに SNP が特定されました。[ 1 ]また、SNP の中でプリン-ピリミジン転座が高頻度で発生していることも観察されました。 [ 1 ] 単一の結腸がん細胞のコピー数と一塩基変異の特性評価により、腫瘍内に存在する異質性が強調されました。[ 1 ]
MALBACは、生殖細胞間の遺伝的多様性を調べる方法として応用されてきた。匿名のドナーから提供された99個のヒト精子細胞のゲノムをシーケンスすることにより、MALBACは単一の配偶子に関わる遺伝子組換えイベントを調べ、最終的に遺伝子組換えのダイナミクスとそれが男性不妊に及ぼす影響についての洞察を提供した。[ 6 ]さらに、個々の精子内では、MALBACは重複または欠失した染色体、および生殖能力に悪影響を及ぼす可能性のあるSNPまたはCNVを特定した。[ 6 ]
MALBACは、他のシングルセルシーケンス技術に比べて多くの重要な進歩をもたらしており、中でも最も重要なのは、ヒト単一細胞のゲノムの93%を報告できることである。[ 1 ]この技術の利点としては、増幅バイアスの低減とゲノムカバレッジの向上、テンプレートDNAの必要量が非常に少ないこと、偽陽性および偽陰性変異率が低いことなどが挙げられる。[ 4 ] [ 6 ]
MALBACは、準線形プレ増幅フェーズを使用することで指数関数的PCR増幅に伴うバイアスを低減する全ゲノムシーケンスの一種です。 [ 1 ] MALBACは、5サイクルのプレ増幅と、27ヌクレオチドの共通配列と8ヌクレオチドの可変配列を含むプライマーを使用して、増幅されたDNA断片（アンプリコン）を生成します。この断片は、追加のコピーと交差ハイブリダイゼーションを防ぐために、自身にループします。[ 1 ] [ 7 ] これらのループは、MALBAC中の増幅のテンプレートとして使用できないため、ポリメラーゼ連鎖反応によるDNA断片の不均一な指数関数的増幅に一般的に伴う増幅バイアスを低減します。[ 1 ] MALBACは、多重置換増幅（MDA）などの他のシングルシーケンス法よりも増幅の均一性が高いとされています。[ 1 ] [ 5 ] MDAはDNAループを使用せず、DNAを指数関数的に増幅するため、バイアスが生じます。[ 1 ] したがって、他のシングルセルシーケンス法に伴う増幅バイアスにより、ゲノムのカバー率が低くなる。[ 1 ] [ 5 ] MALBACに伴うバイアスの低減により、他のシングルセルシーケンス法よりも優れたゲノム配列カバー率が得られている。
MALBACは、循環腫瘍細胞の分析、出生前スクリーニング、法医学サンプルなど、1つまたは少数の細胞しか利用できない場合に、DNAを増幅し、その後シーケンスするために使用できます。[ 4 ] [ 7 ]プロセスを開始するために必要な開始テンプレートは少量（ピコグラムのDNA）だけなので、単一のヒト細胞のシーケンスに理想的な方法です。[ 1 ]
シングルセルシーケンスでは、偽陰性変異率が高いことが多い。[ 1 ]偽陰性変異率は、実際の変異を検出できない確率として定義され、これは、対立遺伝子の喪失または脱落による増幅バイアスが原因で発生する可能性がある。[ 8 ]他のシングルセルシーケンス技術と比較したMALBACのシーケンスカバレッジの均一性により、SNPの検出が向上し、対立遺伝子脱落率が低下した。[ 1 ]対立遺伝子脱落率は、ヘテロ接合体の対立遺伝子が増幅されず、「偽ホモ接合体」が識別された場合に増加する。これは、DNAテンプレートの濃度が低いか、テンプレートの増幅が不均一で、ヘテロ接合体の一方の対立遺伝子が他方よりも多くコピーされることが原因で発生する可能性がある。[ 8 ] MALBACの対立遺伝子脱落率は、約65%であるMDAと比較してはるかに低い（約1%）ことが示されている。バルクシーケンスと比較してSNP検出効率が41%であることが示されているMDAとは対照的に、MALBACはSNP検出効率が76%であることが報告されている。[ 1 ] MALBACは偽陽性率 が低いことも報告されている。MALBACによって生成される偽陽性変異は、主に増幅の最初のサイクル中にDNAポリメラーゼによって導入されたエラーが、その後のサイクルでさらに伝播することによって生じる。この偽陽性率は、単一の細胞から派生した系統内の2～3個の細胞をシーケンスしてSNPの存在を確認すること、および別の系統の無関係な細胞をシーケンスしてシーケンスおよび増幅エラーを排除することによって排除できる。[ 1 ]