Loading article…
TCR-Seq（T細胞受容体シーケンス）は、特定のT細胞とそのクローンを識別および追跡するために使用される方法です。 [ 1 ] TCR-Seqは、既製の分子バーコードとしてT細胞受容体（TCR）の固有の性質を利用します。 [ 1 ]この技術は、シングルセルシーケンス技術とハイスループットスクリーニングの両方に適用できます。[ 1 ]
T細胞は適応免疫系の一部であり、外来病原体から体を守る上で重要な役割を果たしています。[ 2 ] T細胞受容体（TCR）は、T細胞の表面に存在する膜タンパク質のグループであり、外来抗原に結合することができます。[ 3 ] TCRは、細胞表面の主要組織適合性複合体（MHC）と相互作用して抗原を認識します。TCRは、主にα鎖とβ鎖（まれにδ鎖とγ鎖）からなるヘテロ二量体であり[ 4 ]、可変領域と定常領域から構成されています。可変領域は、 VDJ組換えと呼ばれるプロセスによって生成され、その結果、α、β、γ鎖に固有のアミノ酸配列が生じます。その結果、各TCRは固有であり、特定の抗原を認識します[ 4 ]。
相補性決定領域（CDR）はTCRの一部であり、TCR-MHC相互作用において重要な役割を果たします。CDR1とCDR2はV遺伝子によってコードされ、CDR3はV遺伝子とJ遺伝子の間、またはD遺伝子とJ遺伝子の間の領域（まとめて「 VDJ遺伝子」と呼ばれる）から作られます。 [ 4 ] CDR3はCDRの中で最も可変性が高く、抗原と直接接触します。[ 4 ] [ 5 ]そのため、CDR3は固有のT細胞集団を識別するための「バーコード領域」として使用されます。同じ親T細胞から来ない限り、2つのT細胞が同じCDR3配列を持つ可能性は非常に低いからです。[ 4 ] [ 5 ]
VDJ組換えによって膨大な数のユニークなTCRが生成されるため、多くの受容体は最も適した抗原に遭遇することはありません。体内に異物抗原が存在する場合、その抗原を認識する少数のT細胞が積極的に選択され、体が効果的な免疫応答を起こすのに十分な数のT細胞を持つようになります。[ 6 ]選択されたT細胞はクローン増殖と呼ばれるプロセスを経て急速に分裂し、エフェクターT細胞に分化します。[ 7 ]この過程で、最初に抗原を認識したTCR配列（CDR3配列を含む）が保持されます。[ 8 ]
TCR-Seqは、TCRのユニークな性質、特にCDR3を分子バーコードとして利用し、分化や増殖などのさまざまなプロセスを通してT細胞を追跡します[ 9 ]。これは、幅広い目的に使用できます。
TCR シーケンスは、プールされた細胞集団 (「バルク シーケンス」) または単一細胞 (「シングル セル シーケンス」)で実行できます。 [ 4 ]バルク シーケンスは、個人またはサンプル内のすべての TCR である TCR レパートリー全体を調査したり、異なる個人のレパートリー間の比較を作成したりするのに役立ちます。[ 4 ]この方法では、1 つの実験で数百万個の細胞をシーケンスできます。[ 5 ]ただし、1 つの大きな欠点は、バルク シーケンスでは、どの TCR チェーンがペアになっているかを決定することはできず、レパートリー内の頻度しか決定できないことです。サンプリングされる TCR の量が多いということは、存在量の少ない TCR が検出されない可能性があることを意味します。[ 5 ] シングル セル シーケンスでは、TCR チェーン ペアを決定できるため、特定の TCR を識別するのにさらに役立ちます。[ 4 ] [ 5 ]この技術の主な欠点としては、コストが高いこと、[ 4 ]数千個の細胞という限られた容量、[ 5 ]および入手がより困難な生細胞が必要であること[ 4 ]などが挙げられます。
TCR鎖はどれでも配列決定できますが、T細胞集団におけるα鎖とβ鎖の豊富さから、α鎖とβ鎖がより一般的に選択されます。[ 4 ]特にβ鎖は、他の鎖と比較して多様性と特異性が高いため注目されています。β鎖にはα鎖には存在しないD遺伝子成分が存在するため、より多様な組み合わせが可能になります。[ 4 ] [ 10 ]また、β鎖は各T細胞に固有のものであるため、サンプル内の異なるT細胞集団を識別するために使用できます。[ 4 ] [ 5 ] [ 10 ]
TCRシーケンス解析を行うには、集団内のユニークなT細胞の指標として、CDR3領域に対してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を行う。 [ 4 ] [ 10 ] CDR3領域は、抗原との相互作用に直接関与し[ 4 ] [ 10 ]、一般的に同じ系統のTCRに固有のものであるため、異なる集団を識別することができることから、CDR1およびCDR2よりも選択されている[ 10 ]。
このステップの目的は、シーケンス解析を行うための転写産物ライブラリを作成することです。TCRシーケンス解析用のライブラリを作成する方法は主に3つあります。
マルチプレックスPCRは、ゲノムDNA（gDNA）または二本鎖相補DNA（cDNA）に変換されたRNAの両方に適用できます。[ 4 ] JおよびVアレルを標的とするプライマーペアを含むプライマープールを使用して、TCR転写産物のCDR3領域を増幅します。[ 4 ] [ 10 ]転写産物は、目的の領域を増幅するために2回以上のPCRラウンドを経て、得られた転写産物の両端にアダプターが連結されます。[ 10 ]この方法は、プライマープールを介してTCRの多様性の大部分を捉えることができるため、TCR-seq用のライブラリの生成で最もよく使用される方法の1つです。[ 4 ] [ 10 ]しかし、プール内のすべてのプライマーに対してPCR条件を最適化することはほぼ不可能であるため、マルチプレックスDNAでは、結合が弱いプライマーを持つ一部のCDR3領域が増幅されないという増幅バイアスが生じる可能性があります。[ 5 ] [ 10 ]これは、増幅されたセグメントの存在量が細胞内の実際の存在量と一致しない可能性があることを意味します[ 5 ] [ 10 ]
この方法では、ゲノムgDNAまたはcDNAに変換されたRNAを使用できます。[ 4 ] [ 10 ]出発材料は、まず5'末端と3'末端にインデックス付きアダプターを持つDNAまたはcDNA転写産物を生成するように処理されます。[ 4 ]これらの転写産物は、一般的にCDR3領域である目的の領域に結合するように設計されたRNAベイトとともにインキュベートされます。[ 4 ]通常磁気ビーズに結合しているこれらのベイトは、磁石を使用して分離できます。これにより、PCRを使用して増幅できるCDR3領域の転写産物を分離できます。[ 4 ] RNAベイトを使用したターゲット濃縮では、PCR増幅ステップが少なくて済むため、増幅バイアスが減少する可能性があります。[ 4 ]ただし、磁石による捕捉の効率は、増幅された転写産物の多様性に影響を与える可能性があります。
RACE ( Rapid Amplification of cDNA Ends ) は、RNA 転写産物を使用してライブラリーを生成する方法です。[ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] RACE は 3' 末端または 5' 末端に適用できますが、TCR-seq では 5' 末端がより一般的に使用されます。[ 4 ]この方法は、転写産物に共通の 5' アダプター配列を追加することを中心にしており、これはいくつかの異なる方法で行うことができます。[ 11 ] [ 12 ] 1 つの方法は、逆転写後にアダプターを追加することです。RNA テンプレートから逆 DNA 鎖を生成する際に、順方向プライマーが 5' アダプターに相補的な配列を追加し、テンプレートの切り替えにつながります。[ 4 ] [ 10 ] [ 11 ]これにより、相補的な配列が生成されたときに 5' アダプターが cDNA に組み込まれます。[ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] アダプターから定常領域までの全領域を増幅するようにプライマーを設計することができ、[ 4 ] [ 10 ] [ 11 ]次に、2 回目の PCR 反応でアダプターの連結を行うことができます。すべての異なる転写産物が同一のアダプターを共有するため、単一のプライマー ペアを使用して増幅することができます。このように、この方法は増幅バイアスを減らし、よりまれな TCR 集団をより高い確実性で検出する能力を向上させます。[ 4 ] [ 10 ] [ 11 ]ただし、TCR 転写レベルは細胞によって異なるため、この方法では RNA 転写産物のレベルのみに基づいてサンプル中の異なる T 細胞タイプの数を正確に測定することはできません[ 4 ]
ライブラリーの生成後、一般的に次世代シーケンシング（NGS）によって製品をシーケンスすることができます。[ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] CDR3領域は約500塩基対の転写産物の3'末端にあるため、より長いリードが可能で3'末端でのリード品質を維持できるマシンを使用することが重要です[ 10 ]。
NGSのエラー率はTCRレパートリーの解析において課題となっている。[ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] TCRのわずかな変異は抗原に対する特異性を変化させる可能性があり、[ 10 ]そのため研究者にとって興味深いものとなる可能性がある。しかし、シーケンスエラーは、低頻度で異なるTCR集団として解釈される可能性のあるわずかな変化を生み出す可能性があり、[ 10 ]これはTCRレパートリーの変化を解析する際に問題となる。解析から低存在量のリードを除去するための閾値を設定したり、これらのエラーを修正するアルゴリズムを開発したりする努力がなされてきた。[ 10 ]
一般的に、TCR-seq から収集されたデータは、同じ患者の異なる時点間、または異なる患者間で TCR レパートリーを比較するために使用されます。[ 4 ] [ 10 ] [ 11 ]最近の研究では、健康なレパートリーの特徴が調べられ、TCR β 鎖のレベルとタイプに高い変動性があることがわかりましたが、サブセットは異なる個人間で共有されています。[ 10 ]しかし、この多様性は、感染率や癌の再発の可能性など、関心のある状態と強く相関することがまだ示されておらず、[ 10 ]さらなる研究が必要であることを示唆しています。
T細胞のクローン増殖により、免疫系はさまざまな感染症に高い特異性で対処できるようになります。[ 13 ]したがって、疾患感染後にT細胞レパートリーに起こる変化を理解することで、早期診断、疾患モニタリング、および治療法の開発が可能になります。[ 5 ]
後天性免疫不全症候群（AIDS）は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染によって引き起こされる壊滅的な疾患であり、CD4+ T細胞の死滅[ 14 ]とCD8+ T細胞の機能不全[ 5 ]をもたらします。最近の研究では、TCRの多様性の増加がHIVの多様性を減少させ、疾患の進行を制限する可能性があることが示唆されています[ 5 ] [ 15 ]。TCRの配列決定は、AIDSの進行の理解を深め、罹患率を予測することにもつながります[ 5 ] 。さらに、AIDS感染に対する自然防御を持つ個人のTCRレパートリーの配列決定[ 16 ]は、疾患のさらなる蔓延を制限するワクチンの開発に役立つ可能性があります[ 5 ]。
がんは、全身に広がる可能性のある悪性細胞の制御不能な増殖です。[ 17 ]これは、がん細胞内の突然変異によって引き起こされ、多くの場合、ネオアンチゲンと呼ばれる変異タンパク質の発現につながります。[ 5 ] [ 17 ]これらのネオアンチゲンの同定は、正常細胞を傷つけることなくがん細胞を標的にするために利用できるため、治療上の大きな利点があります。CD8+ T細胞はTCRでいくつかのネオアンチゲンを認識できるため、TCRレパートリーのシーケンスは潜在的ながんバイオマーカーの同定に役立ちます。[ 5 ]バイオマーカーの同定に加えて、TCRレパートリーのシーケンスは、がんの進行の変化を追跡し、免疫療法への反応を評価し、[ 18 ]腫瘍微小環境を評価することもできます。癌の増殖を許容する可能性のある条件のため[ 5 ]